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1、體細(xì)胞核移植中供體細(xì)胞的準(zhǔn)備與孤雌激活方法的研究PreparationoftheDonorCellsandResearchoftheParthenogeneticActivationinSomaticCellNuclearTransfer研究生：楊麗華導(dǎo)師：邢華揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院二零一二年四月一夸一一，年四月本研究由農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(編號：20112x08008—004)資助楊麗華：核移植中供體細(xì)胞的準(zhǔn)備‘孑孤雌激活方法的研究核移植中供體細(xì)胞的準(zhǔn)備與孤雌激活方法的研究中文摘要研究背景與目的1997年，世界上首例體細(xì)胞
2、克隆動物一“多莉”(Dolly)綿羊的誕生，標(biāo)志著人類對哺乳動物體細(xì)胞核移植的研究翻開了新的一頁。隨后動物克隆成了世界范圍內(nèi)生物界研究的熱點，但是目前總體來說體細(xì)胞核移植的成功率還很低，這主要是因為人們對核移植技術(shù)本身所蘊涵的規(guī)律還沒有完全掌握，因此利用質(zhì)優(yōu)價廉的動物模型，如小鼠、大鼠、家兔等，加強核移植技術(shù)的基礎(chǔ)研究具有十分重要的理論及現(xiàn)實意義。體細(xì)胞核移植作為一項動物克隆技術(shù)，它包含有核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備、受體細(xì)胞的準(zhǔn)備、供體細(xì)胞與受體細(xì)胞質(zhì)的融合、重構(gòu)胚的激活、培養(yǎng)等多個技術(shù)環(huán)節(jié)，任何一個環(huán)節(jié)的失誤都有可能對最終的結(jié)果產(chǎn)生很大的影
3、響。本實驗就體細(xì)胞核移植過程中供體細(xì)胞的準(zhǔn)備以及卵母細(xì)胞孤雌激活這兩個方面進(jìn)行研究，旨在建立供體細(xì)胞體外培養(yǎng)體系、篩選出最優(yōu)的供體細(xì)胞周期同步化和凍存復(fù)蘇方法，以及通過卵母細(xì)胞孤雌激活方法的研究為核移植重構(gòu)胚的激活提供必要的技術(shù)參數(shù)和實驗數(shù)據(jù)，從而最終提高大動物體細(xì)胞核移植的成功率。研究內(nèi)容與方法(1)供體細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的建立：以酶消化法從孕13．5天(d)的B6D2Fl胎鼠中分離小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MouseEmbryonicFibroblasts，MEF)，并以2x107個／mL的密度接種于DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，24h后
4、首次換液，當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底800／o---90％左右時，以2×105個／mL進(jìn)行傳代培養(yǎng)，借助傳代和細(xì)胞優(yōu)勢的自然選擇進(jìn)行自然純化。(2)MEF周期同步化方法的選擇：取第三代匯合至70％80％的MEF進(jìn)行Go／Gl期同步化處理，實驗中使用血清饑餓、接觸抑制、Roscovitine作用這三種方法進(jìn)行G0／Gl期同步化處理，將同步化處理后的MEF用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測，并與未處理的對照組相比較，根據(jù)GdGl期細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例，最終篩選出MEF周期同步化的最優(yōu)方法。(3)MEF凍存方法的篩選：取第三代匯合至70％～80％的MEF進(jìn)
5、行凍存處理，實驗中選用DMSO為凍存保護(hù)劑，使用不同的DMSO濃度(5％、10％、15％)及不同的凍存程序進(jìn)行細(xì)胞凍存，通過復(fù)蘇后的細(xì)胞活力及24h貼壁率來檢測凍存效果，從而得到最優(yōu)的細(xì)胞凍存的方法。(4)卵母細(xì)胞孤雌激活方法的篩選：實驗選用乙醇(Ethanol，EH)及氯化鍶(SrCh)分別聯(lián)合細(xì)胞松弛素B(CytochalasinB，CB)作為孤雌激活劑，并從激活胚齡、激活劑濃度、激活時間三個方面對B6D2Fl小鼠的卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活，通過激活率以及激活后培養(yǎng)的卵裂率、囊胚形成率來檢測激活效果，確定最優(yōu)的卵母細(xì)胞孤雌激活程序。
6、楊麗華：核移植中供體細(xì)胞的準(zhǔn)備’j孤雌激活方法的研究結(jié)果(1)供體細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的建立：將MEF接種于DMEM完全培養(yǎng)基中，原代培養(yǎng)約12h開始貼壁，胞質(zhì)向外伸出偽足而形成梭形、多邊形或不規(guī)則異形等形狀，原代MEF中雜細(xì)胞較多，傳代至第三代細(xì)胞得到自然純化，雜細(xì)胞較少，細(xì)胞增殖迅速，排列有序，呈放射狀或漩渦狀排列。(2)MEF周期同步化方法的篩選：經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，以血清饑餓72h處理方法最優(yōu)，其得到最高的Go／Gl期細(xì)胞比例(87．19％)，與對照組及其他實驗組相比有明顯的優(yōu)勢。(3)MEF凍存方法的篩選：通過凍存復(fù)蘇后細(xì)胞活力
7、與24h貼壁率的比較，選用10％DMSO+10％FBS+80％DMEM．HG為凍存液，將冷凍管置于隔熱的泡沫塑料盒中，在4。C下平衡兩小時后放入．76。C冰箱中過夜，次日將冷凍管移入一196℃液氮中保存的凍存方式，可以得到最佳的細(xì)胞凍存效果(細(xì)胞活力：76．9％；24h貼壁率：70．8％)，且MEF經(jīng)復(fù)蘇后細(xì)胞形態(tài)與凍存前未見明顯差別，傳代后細(xì)胞狀態(tài)良好且保持很強的活力。(4)卵母細(xì)胞孤雌激活方法的研究：實驗表明以10mmol／LSrCl2+CB作為激活劑，選用卵齡為18h的卵母細(xì)胞，并對其激活2h，可以得到較高的激活率(80．9％
8、)，激活后的卵母細(xì)胞的狀態(tài)較好，后續(xù)發(fā)育能力較強，得到的卵裂胚胎及囊胚較多質(zhì)量也較好(卵裂率：56．1％；囊胚發(fā)生率：28．4％)，部分囊胚經(jīng)過繼續(xù)培養(yǎng)還有繼續(xù)孵出的能力。結(jié)論以酶消化法得到的MEF能在DMEM完全培養(yǎng)基中穩(wěn)定擴(kuò)增，且
