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1、第42卷分析化學(xué)(FENXIHUAXUE)研究簡(jiǎn)報(bào)第8期2014年8月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1205～120910．11895／j．issn．0253-3820．140190基于胸腺嘧啶．三聚氰胺-胸腺嘧啶結(jié)構(gòu)和SYBRGreenI熒光檢測(cè)牛奶中三聚氰胺歐麗娟劉宏偉劉開建(湖南工學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，衡陽(yáng)421002)(湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410082)摘要基于胸腺嘧啶(T)一三聚氰胺一T特異性結(jié)構(gòu)，建立了SYBRGreenI熒光均相檢
2、測(cè)三聚氰胺的方法。聚氰胺不存在時(shí)，SYBRGreenI與聚T單鏈DNA結(jié)合較弱，熒光信號(hào)較弱；三聚氰胺存在時(shí)，聚T單鏈DNA通過T．二三聚氰胺一T錯(cuò)配形成折疊結(jié)構(gòu)。SYBRGreenI嵌入雙鏈DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，釋放出強(qiáng)熒光信號(hào)。結(jié)果表明，三聚氰胺濃度在0．1～10I~mol／L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為35nmol／L。本方法簡(jiǎn)單、快速、成本低、靈敏度高。關(guān)鍵詞T一三聚氰胺一T；SYBRGreenI；熒光檢測(cè)；三聚氰胺1引言三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，其含氮量高，約為66．6％_1，遠(yuǎn)高于蛋白質(zhì)(平均含
3、氮量16％)?，F(xiàn)用檢測(cè)食品中蛋白質(zhì)含量的方法為凱氏定氮法，它通過檢測(cè)食品中的含氮量確定蛋白質(zhì)的含量。因此，食品或飼料中添加三聚氰胺，會(huì)使蛋白質(zhì)含量虛高。同時(shí)，三聚氰胺作為一種白色結(jié)晶粉末，無味，摻雜后不易被發(fā)現(xiàn)，從而使劣質(zhì)食品和飼料在檢測(cè)時(shí)蒙混過關(guān)。三聚氰胺與尿酸結(jié)合生成難溶于水的結(jié)石j，對(duì)人體健康構(gòu)成威脅，甚至可能引起嬰幼兒死亡。因此，準(zhǔn)確測(cè)定食品及飼料中的三聚氰胺含量具有重要意義。傳統(tǒng)的檢測(cè)三聚氰胺的方法有氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法]、酶聯(lián)免疫檢測(cè)法]、高效液相色譜法等。但是這些方法操作復(fù)雜，需要高素質(zhì)的操作人員或者分析時(shí)間較
4、長(zhǎng)，不能滿足日常快速分析的要求。近年發(fā)展了一些檢測(cè)三聚氰胺的新方法，如電化學(xué)方法、化學(xué)發(fā)光法、納米材料比色法、熒光探針法¨?和表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)¨。盡管這些方法檢出限低、靈敏度高，但是預(yù)處理復(fù)雜耗時(shí)，需要衍生過程或者昂貴的儀器。最近研究發(fā)現(xiàn)，三聚氰胺可以通過分子間氫鍵介導(dǎo)胸腺嘧啶(T)配對(duì)，形成穩(wěn)定的．r_三聚氰胺一T特異性結(jié)構(gòu)¨n15j。Huang研究小組利用此原理實(shí)現(xiàn)了對(duì)三聚氰胺的比色檢測(cè)。聚T鏈在納米金表面吸附后，在一定鹽離子存在下，通過T一三聚氰胺一T特異性作用，納米金顆粒團(tuán)聚，宏觀上發(fā)生由紅色到藍(lán)色的顏色變化。盡
5、管上述方法提高了三聚氰胺檢測(cè)的靈敏度，且具有較好的特異性，但需要合成納米金，操作復(fù)雜，成本高。SYBRGreenI(SG)是一種雙鏈DNA熒光染料。與單鏈DNA單獨(dú)存在時(shí)顯示非常弱的熒光，與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光信號(hào)大大增強(qiáng)¨”]。本研究利用T與三聚氰胺的特異性結(jié)合，設(shè)計(jì)了一種均相檢測(cè)三聚氰胺的熒光傳感方法。三聚氰胺的存在促使聚T單鏈DNA改變其構(gòu)象，形成折疊結(jié)構(gòu)，SYBRGreenI(SG)與雙鏈DNA結(jié)合產(chǎn)生強(qiáng)的熒光信號(hào)。本方法簡(jiǎn)單，快速，成本低，靈敏度高，可用于食品中三聚氰胺的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。2實(shí)驗(yàn)部分2．1儀器與試劑H
6、itachiF-7000熒光分光光度計(jì)(日本Hitachi公司)，激發(fā)波長(zhǎng)480／1111，掃描范圍505～580nm，激2014~2-28收稿；2014-044)3接受本文系國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos．21205035)，湖南省自然科學(xué)基金(Nos．12JJ4017，13JJ3123)和湖南省重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目資助E—mail：oulijuanann@aliyan．tom分析化學(xué)第42卷發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設(shè)為5．0nIT!。三聚氰胺(上海百靈威科技有限公司)；SYBRGreenI(SG，10000×，北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)
7、；DNA鏈(由大連寶生物有限公司合成)；其它試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水(電阻大于18．3Mn)。2．2三聚氰胺的檢測(cè)在25反應(yīng)體系中包含10mmol／L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7．4，200mmol／LNaC1)、30nmolfL聚T核酸鏈，2xSG；加入系列濃度的三聚氰胺，混合均勻后，室溫下避光培育30rain后，稀釋到100L，放人熒光光譜儀，檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度。3結(jié)果與討論3．1實(shí)驗(yàn)原理基于三聚氰胺特異性DNA和SCI熒光定量檢測(cè)三聚氰胺的原理如圖1所示。三聚氰胺不存在時(shí)，聚T鏈為柔性的單鏈結(jié)構(gòu)，熒光信號(hào)很弱。因
8、為sGI是一種雙鏈核酸染料，與單鏈DNA的結(jié)合較弱，游離狀態(tài)下的SYBRGreen1只能發(fā)出微弱的熒光。當(dāng)三聚氰胺存在時(shí)，三聚氰胺能夠與胸腺嘧啶(T)通過分子間氫鍵形成T一三聚氰胺一T的特異性結(jié)構(gòu)(圖1B)，使聚T鏈發(fā)生折疊。SGI嵌入雙鏈DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，在528nlxl處釋放出強(qiáng)的
