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1、第四節(jié)微生物的固氮作用氮是組成生物細(xì)胞必不可少的重要元素之一。氮?dú)?N2)約占空氣總體積的78%，但由于N≡N三鍵非常穩(wěn)定，故N2不能被高等生物和大多數(shù)微生物利用，只有少數(shù)原核微生物能直接利用N2作氮源，將其還原成氨，供植物和其他微生物利用。固氮微生物利用固氮酶的催化作用將分子態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨的過(guò)程稱為生物固氮。生物固氮是地球上僅次于光合作用的第二大生物化學(xué)反應(yīng)。生物每年在溫和條件下的固氮量約為高溫高壓(300℃×300個(gè)大氣壓)條件下工業(yè)固氮量的2倍多，約為1億噸，故生物固氮對(duì)地球生態(tài)系統(tǒng)中的氮素循環(huán)和生物的生息繁衍具有
2、十分重要的作用。1.固氮微生物的種類自1886年M.W.Beijerinck分離到能共生固氮的根瘤菌后，人們共發(fā)現(xiàn)了50多屬100多種生物有固氮能力，這些生物均為原核生物。按其固氮方式可分為3種類型：能獨(dú)立固氮的微生物稱為自生固氮菌；必須與其他生物共生才能固氮的微生物稱為共生固氮菌；必須生活在植物根際、葉面或腸道等處才能固氮的微生物稱為聯(lián)合固氮菌。自生固氮菌好氧化能異養(yǎng)：固氮菌屬(Azotobacter)拜葉林克氏菌屬(Beijerinckia)固氮單胞菌屬(Azomonas)固氮球菌屬(Azococcus)德克斯
3、氏菌屬(Derxia)黃色分枝桿菌(Mycobacteriumflavum)自養(yǎng)棒桿菌(Corynebacteriumautotrophicum)產(chǎn)脂螺菌(Spirillumlipoferum)甲烷氧化菌等化能自養(yǎng)：氧化亞鐵硫桿菌(Thiobacillusferroxidans光能自養(yǎng)：念珠藍(lán)菌屬(Nostoc)魚腥藍(lán)菌屬(Anabaena)著色菌屬(Chromatium)綠假單胞菌屬(Chloropseudomonas)微好氧(化能異養(yǎng))：棒桿菌屬(Corymebacterium)固氮螺菌屬(Azospirill
4、um)兼性厭氧化能異養(yǎng)：克雷伯氏菌屬(Klebsiella)無(wú)色桿菌屬(Achromobacter)多粘芽孢桿菌(Bacilluspolymyxa)檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)歐文氏菌屬(Erwinia)腸桿菌屬(Enterobacter)光能異養(yǎng)：紅螺菌屬(Rhodospirillum)紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)厭氧化能異養(yǎng)：巴氏梭菌(Clostridiumpasteurianum)脫硫弧菌屬(Desulforibrio)脫硫腸狀菌屬(Desulfotomaculum)共生固氮
5、菌根瘤豆科植物：根瘤菌屬(Rhizobium)非豆科植物：弗蘭克氏菌屬放線菌(Frankia)白蟻等動(dòng)物腸道：腸桿菌屬(Enterobacter)植物地衣：念珠藍(lán)菌屬(Nostoc)魚腥藍(lán)菌屬(Anabaena)(單歧藍(lán)菌屬)等(Tolypothrix)滿江紅：滿江紅魚腥藍(lán)菌(Anabaenaazollae)蘇鐵珊瑚根：Nostoc,Anabaena肯乃拉草：Nostoc聯(lián)合固氮菌根際溫帶：Bacillus，Klebsiella熱帶：雀稗固氮菌(Azotobacterpaspali)，Azospirillum,B
6、eijerinckia葉面：Beijerinckia,Azotobacter2.固氮的生化機(jī)制固氮酶：生物固氮反應(yīng)的核心。1960年，J.E.Carnahan從巴氏梭菌(Clostridiumpasteurianum)中獲得了具有固氮活性的無(wú)細(xì)胞抽提液，實(shí)現(xiàn)了分子氮還原為NH3的實(shí)驗(yàn)。1966年，L.Mortenson從巴氏梭菌(C.Pasteurianum)和維涅蘭德固氮菌(Azotobactervinelandii)的無(wú)細(xì)胞抽提液中，分離出兩種固氮蛋白—鉬鐵蛋白和鐵蛋白，使固氮研究進(jìn)入分子水平。固氮反應(yīng)的必要條件
7、：大量ATP還原力NAD(P)H2固氮酶N2Mg2+嚴(yán)格的厭氧微環(huán)境固定1molN2需要消耗10～15molATP。這些ATP由呼吸、發(fā)酵或光合磷酸化過(guò)程提供。從不同生理類型的固氮微生物細(xì)胞中抽提到的固氮酶具有相同結(jié)構(gòu)，它們均含Ⅰ、Ⅱ兩種組分。組分Ⅰ為鉬鐵蛋白(MF)或鉬鐵氧還蛋白(MoFd)，是真正的“固氮酶”；組分Ⅱ?yàn)殍F蛋白(F)，是固氮酶還原酶。固氮酶的Ⅰ、Ⅱ兩種組分項(xiàng)目組分Ⅰ組分Ⅱ蛋白質(zhì)亞基數(shù)4(2大2小)2(相同)分子量22萬(wàn)左右六萬(wàn)左右Fe原子數(shù)30(24～32)4不穩(wěn)態(tài)S原子數(shù)28(20～32)4Mo原
8、子數(shù)20Cys的SH基數(shù)32～3412活性中心鐵鉬輔因子(FeMoCo)電子活化中心(Fe4S4)功能絡(luò)合、活化和還原N2傳遞電子到組分Ⅰ上固氮酶活力測(cè)定：測(cè)定固氮酶活力的經(jīng)典方法有微量K氏定氮法和同位素法，但前者精度低，后者程序復(fù)雜。1966年，M.J.Dilworth等發(fā)表了靈敏簡(jiǎn)便的乙炔還原法，促進(jìn)了固氮酶活性及固氮機(jī)理研究
