大豆RAPD分析體系的優(yōu)化.pdf

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1、鼗黼栽培育種<以大豆為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)中主要影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的幾個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，獲到最佳的反應(yīng)條件及反應(yīng)體系，即在總體積為20L的RAPD反應(yīng)體系中，5種主要成分的最適用量分別是DNA模板20．00ng、M3．00mmol／L、dNTPs10000mol／L、引物0．20“m0l，L、Taq酶1．00U。大豆RAPD分析體系的優(yōu)化文／于妍唐敬仙RAPD是由美國(guó)學(xué)者William本原理在于應(yīng)用RAPD引物隨機(jī)擴(kuò)靈敏度高、通用性好及DNA用量較和Welsh領(lǐng)導(dǎo)的2個(gè)研究小組于增而產(chǎn)生的DNA片段長(zhǎng)度的多態(tài)性。少等優(yōu)勢(shì)。為確保RAPD分析結(jié)果1990年在PCR

2、基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一該標(biāo)記與其他DNA標(biāo)記技術(shù)相比較，的可靠性、穩(wěn)定性，以大豆為實(shí)驗(yàn)材種新型的DNA分子標(biāo)記技術(shù)。其基具有操作簡(jiǎn)單、迅速、準(zhǔn)確、費(fèi)用低、料，研究其反應(yīng)體系中幾種因子變化基金項(xiàng)目：吉林省教育廳“十二五”科研計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)為吉教科合字【2012】第515號(hào))，長(zhǎng)春科技學(xué)院科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目。11．6g，中谷1穗粒質(zhì)量17．0g，中谷m穗數(shù)X穗粒質(zhì)量×85．0％／但單穗粒質(zhì)量較高，為17．0g，所以1穗粒質(zhì)量較高，比豫谷18重5．4g，1000=2．78X1000Xl1．6×85．0％／667m產(chǎn)量較高，為328．0kg，比豫比豫谷18增加46．

3、6％。1000=274．1kg／667m，中谷1谷18增產(chǎn)53．9kg，增產(chǎn)19．7％。株2．j．5千粒質(zhì)量豫谷18千粒質(zhì)量實(shí)際測(cè)產(chǎn)376．7kg／667m2，計(jì)算產(chǎn)草質(zhì)量、出谷率、千粒質(zhì)量中谷1都2．6g，中谷1千粒質(zhì)量2．8g，中谷量為：2．27X10000X17．0X85．0％／較豫谷l8高。1千粒質(zhì)量比豫谷l8重0。2g。1000=328．01~／667m2。中谷l較豫雖然中谷18生育期稍長(zhǎng)，但在實(shí)2．5．4株草質(zhì)量豫谷18單株株草質(zhì)谷l8產(chǎn)量高53．9l(g，較豫谷18增產(chǎn)際生產(chǎn)上2個(gè)品種谷子都是9月18日量11．2g，中谷1單株株草質(zhì)量15．5g，

4、19．7％。收割的，本示范測(cè)產(chǎn)產(chǎn)量為2個(gè)品種9中谷1株草質(zhì)量比豫谷18重4．3g。3小結(jié)月17日同期收獲產(chǎn)量，如果正常成熟2．5．5出谷率豫谷18出谷率豫谷l8雖然667in成穗較高，收獲，產(chǎn)量還會(huì)更高。77．9％，中谷1出谷率87．6％，中谷1為2．78萬(wàn)／667m，但單穗粒質(zhì)量出谷率比豫谷18高。較低，11．6g。所以，667m產(chǎn)量低(作者單位：北京市門(mén)頭溝區(qū)農(nóng)業(yè)2．5．6667m產(chǎn)量豫谷18實(shí)際測(cè)產(chǎn)于中谷1，為274．1kg。中谷1雖然綜合服務(wù)中心102300)313．3kg／667m，計(jì)算產(chǎn)量為：667667m成穗低，為2．27萬(wàn)／667m，34北京農(nóng)

5、業(yè)2015年7月下旬刊栽培育種覆艘齲巍對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響，以建立最優(yōu)的反應(yīng)體系。1材料與方法1．1材料1．1．1實(shí)驗(yàn)材料供試品種為普通栽培大豆。1．1．2試劑EDTA、dNTPs、CTAB、氯化鎂、TaqDNA聚合酶、Tris—HC1、10×PCRBuffer、氯仿／異戊醇(24：1)、TE緩沖液、瓊脂糖、異戊醇及70％乙醇及氯化鉀等。1．2實(shí)驗(yàn)方法1．2．1DNA的提取利用CTAB法從幼葉中提取基因組DNA。1．2．2RAPD反應(yīng)體系的建立首先確定總體積為20L的PCR反應(yīng)體系中模板DNA、氯化鎂、引物、TaqDNA聚合酶、dNTP的最適濃度。2結(jié)果與分析2．

6、5Mg2濃度優(yōu)化Mg濃度會(huì)1)dNTPs濃度優(yōu)化：檢驗(yàn)25．00、2．1dNTPs濃度優(yōu)化設(shè)計(jì)的6個(gè)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生影響，主要是由于50．00、100．00、125．00、150．00濃度梯度均有條帶產(chǎn)生，但濃度在Mg濃度會(huì)影響到聚合酶的活性。從mol／L和200．00mol／L6個(gè)100．00“mol／L時(shí)，擴(kuò)增的條帶最多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，Mg用量過(guò)高或dNTPs濃度梯度對(duì)反應(yīng)的影響。2)引且清晰?？梢?jiàn)，在20“L反應(yīng)體系中過(guò)低時(shí)反應(yīng)效果均不好，故反應(yīng)體系中物濃度優(yōu)化：檢驗(yàn)0．05、0．10、0．20、dNTPs濃度應(yīng)設(shè)為100．00mol／L。M濃度以3

7、mmol／L左右較理想。0．30、0．40mol／L和0．50mol／L2．2引物濃度優(yōu)化引物濃度低于3結(jié)論6個(gè)引物濃度對(duì)反應(yīng)的影響。3)Taq0．05mol／L時(shí)，擴(kuò)增效果不好，在經(jīng)實(shí)驗(yàn)得出，適合大豆RAPD反聚合酶用量?jī)?yōu)化：檢驗(yàn)0．25、0．50、0．10～0．50mol／L則對(duì)擴(kuò)增結(jié)果應(yīng)的最佳體系為：在2OL的反應(yīng)體0．75、1．00、1．25U和1．50U6影響不大。但是從整體效果來(lái)看，認(rèn)系中含模板DNA20．0ng、引物0．20個(gè)Taq酶用量梯度對(duì)反應(yīng)的影響。為在20“L反應(yīng)體系中引物濃度以“mol／L、dNTPs100．00I

8、mol／L、4)模板

9、濃度優(yōu)化：檢驗(yàn)2．5、5．0、0．20