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《農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆未成熟子葉節(jié)的遺傳轉(zhuǎn)化-論文.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、河北科技師范學(xué)院學(xué)報(bào)第27卷第1期，2013年3月JournalofHebeiNormalUniversityofScience&TechnologyVo1．27No．1March．2013DOI：10．3969／J．ISSN．1672-7983．2013．O1．001農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆未成熟子葉節(jié)的遺傳轉(zhuǎn)化鐘磊，王林紅，喬亞科，崔姍姍，紀(jì)展波，李桂蘭(河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院，河北秦皇島，066600)摘要：以冀豆7號未成熟子葉節(jié)為轉(zhuǎn)化受體，研究外植體取材時(shí)間、低溫預(yù)處理、共培養(yǎng)溫度及光照時(shí)間對農(nóng)桿
2、菌介導(dǎo)大豆轉(zhuǎn)化抗性芽的影響。結(jié)果表明，以開花后6O一66d進(jìn)行外植體取材的子葉節(jié)產(chǎn)生的抗性芽數(shù)量較多；共培養(yǎng)溫度26℃，光照時(shí)間24h／d有利于抗性芽產(chǎn)生，而外植體4低溫預(yù)處理不利于抗性芽產(chǎn)生。分析不同品種抗性芽誘導(dǎo)率發(fā)現(xiàn)，不同基因型未成熟子葉節(jié)抗性芽發(fā)生率不同，其中以豫豆22，冀豆7號和品系12的抗性芽誘導(dǎo)率較高。關(guān)鍵詞：大豆；農(nóng)桿菌介導(dǎo)；未成熟子葉節(jié)；抗性芽誘導(dǎo)中圖分類號：S565．103．52文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1672-7983(2013)01-0001-04大豆是公認(rèn)的較難進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的
3、植物之一。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化是最早被開發(fā)出來并且是目前應(yīng)用最廣泛的一種轉(zhuǎn)基因技術(shù)?，該法具有操作簡單，費(fèi)用低廉，可插入基因片段大，不容易發(fā)生重排等優(yōu)點(diǎn)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化所用的外植體主要有子葉節(jié)J、無菌苗的莖尖J、未成熟胚子葉J、上胚軸和初生葉]、子葉¨、成熟胚的胚尖、未成熟胚體細(xì)胞胚¨等，而對利用未成熟大豆種子子葉節(jié)的轉(zhuǎn)化研究報(bào)道則較少。筆者以不同大豆品種的未成熟種子子葉節(jié)為轉(zhuǎn)化受體，研究其遺傳轉(zhuǎn)化影響因素，為提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率提供依據(jù)。1材料和方法1．1材料供試大豆品種：冀豆7號，豫豆22，九農(nóng)2
4、6，鄭97196，品系1O，品系12。植物表達(dá)載體：pX6PTF1(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)張彩英研究員提供)。1．2方法1．2．1外植體的制備選取開花后不同發(fā)育時(shí)期的大豆豆莢，清水沖洗表面，體積分?jǐn)?shù)為0．75的酒精消毒1min，無菌水沖洗1次，質(zhì)量濃度為1．0g／L的氯化汞溶液消毒10min，無菌水沖洗3次。無菌條件下取出未成熟種子，滅菌的液體共培養(yǎng)基(或無菌蒸餾水)浸泡15min，去掉種皮，將2片子葉從胚軸縱切，去除幼芽和胚尖。1．2．2茵液制備挑取工程菌的單菌落，接種到鏈霉素、壯觀霉素質(zhì)量濃度為50mg／L
5、的LB液體培養(yǎng)基中，180r／min，28oC振蕩培養(yǎng)2—3d至OD60o=0．6～0．8。隨后吸取OD600=0．6～0．8菌液，接種到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)至DD600=0．3—0．5。將菌液5000r／rain，4℃離心10min，棄上清，沉淀重懸于與共培養(yǎng)基成分相同的液體培養(yǎng)基中，調(diào)整菌液濃度至OD。。=0．3～0．5，備用。1．2．3共培養(yǎng)將制備好的農(nóng)桿菌菌液侵染外植體30min，接種到共培養(yǎng)基，24。《二恒溫培養(yǎng)4d。1．2．4掘}生植株再生共培養(yǎng)后經(jīng)抗性芽誘導(dǎo)、伸長、生根、移
6、栽和馴化后獲得抗性植株。1．3試驗(yàn)設(shè)計(jì)1．3．1子葉節(jié)預(yù)處理試驗(yàn)以冀豆7為材料，對所取材料分別進(jìn)行如下預(yù)處理：處理1，對去除莢皮的種子在4℃下處理24h，切制子葉節(jié)；處理2，將豆莢在4℃低溫處理24h，然后消毒后除去豆莢皮切制子葉節(jié)；處理3，取新鮮豆莢直接去莢皮后切制子葉節(jié)?；痦?xiàng)目：國家農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(項(xiàng)目編號：2009ZX08004-001B；2009ZX08004-O04B)；河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號：C2009000868)；河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號：112
7、20107D)。通訊作者，女，lg~，教授。主要研究方向：植物分子生物學(xué)與基因工程。E-mail：lg163@126．corn。收稿日期：2012-05-23；修改稿收到日期：2013-02-222河北科技師范學(xué)院學(xué)報(bào)27卷1．3．2共培養(yǎng)溫度試驗(yàn)以開花60d的冀豆7未成熟種子為材料，共培養(yǎng)溫度設(shè)置3個(gè)處理：22，24，26℃。1．3．3共培養(yǎng)光照試驗(yàn)以開花60d的冀豆7未成熟子葉節(jié)為外植體，共培養(yǎng)時(shí)設(shè)置3個(gè)光照長度處理：0，16，24h／d。1．3．4不同品種試驗(yàn)以豫豆22，冀豆7號，鄭97196，
8、九農(nóng)26，品系1O和品系12為受體品種，取開花60d的未成熟種子制備子葉節(jié)外植體。每個(gè)單因素試驗(yàn)中每個(gè)處理切制外植體5O個(gè)，3次重復(fù)。1．4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)應(yīng)用DPSv7．05版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果與分析2．1種子成熟度對大豆未成熟子葉節(jié)轉(zhuǎn)化抗性芽誘導(dǎo)的影響以冀豆7號為材料，分析開花后50，60，67d未成熟種子子葉節(jié)外植體的芽誘導(dǎo)率發(fā)現(xiàn)，以開花后60d，種子達(dá)到最飽滿程度所制備的外植體抗性芽誘導(dǎo)率和平均抗性芽數(shù)最高，與開花后50d的和開花后67
