【綜述】無(wú)篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因作物的研究進(jìn)展.doc

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1、無(wú)篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因作物的研究進(jìn)展屮國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院生物技術(shù)研究所曹建隨著生物技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成為作物冇種的一種重要手段并且已經(jīng)取得顯著的成就。從2004年批準(zhǔn)的第一個(gè)商業(yè)化轉(zhuǎn)基因大豆起至2010年我國(guó)含Bt基因的轉(zhuǎn)基因水稻和含phyA基因的轉(zhuǎn)基因玉米相繼獲得了安全證書(shū)，轉(zhuǎn)基因的安全性也越來(lái)越受到公眾的關(guān)注。這其屮包括轉(zhuǎn)基因作物木身的安全性及轉(zhuǎn)基因作物存在的篩選標(biāo)記的安全性。大部分的轉(zhuǎn)基因技術(shù)都得借助抗性基因篩選轉(zhuǎn)化了，從而引起了公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因作物安全性的擔(dān)憂(yōu),這些安全性包括對(duì)環(huán)境和人類(lèi)木身，極大地阻礙了轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化的進(jìn)

2、程。此外，這些篩選標(biāo)記的存在給基因聚合帶來(lái)了巨大的困難。因此，消除篩選標(biāo)記成為了轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用的一大難題。為了消除轉(zhuǎn)基因作物屮的篩選標(biāo)記，一種全新的策略即獲取無(wú)選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因技術(shù)迅速發(fā)展起來(lái)。該技術(shù)一方面能夠獲得所需的轉(zhuǎn)基因植株，另一方血又能消除標(biāo)記基因,因而受到了轉(zhuǎn)基因作物冇種學(xué)家的推崇，成為現(xiàn)階段轉(zhuǎn)基因作物育種的主要手段，極大地推動(dòng)了轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展。木文主要對(duì)無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因技術(shù)不同方法做一論述。131共轉(zhuǎn)化一分離的方法(Co-Transformation-Segregationmethod)所謂的共轉(zhuǎn)化(co-transfor

3、mation)是指將不同的外源基因分別構(gòu)建到不同的載體或同一載體的不同區(qū)段，將多種載體同時(shí)轉(zhuǎn)入同一受體細(xì)胞，篩選出共轉(zhuǎn)化植株。它為無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供了一種可行的方法，分別將目的基因和篩選標(biāo)記構(gòu)建到不同的載體上，通過(guò)共轉(zhuǎn)化使其整合到植物基因纟R,由于自身不連鎖，其可能整合到基因纟ft的不同位點(diǎn)，T2便會(huì)出現(xiàn)彼此分離的植株(SripriyaRet.al2008)。通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒êY選便可獲得無(wú)篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株。該方法消除篩選標(biāo)記原理簡(jiǎn)單，而在具體使用過(guò)程屮卻有不同的途徑。13.1.1農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雙T-DNA載體的共轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的共

4、轉(zhuǎn)化方法已經(jīng)成功的應(yīng)用于篩選標(biāo)記的剔除。分別將含篩選標(biāo)記基因和目的基因的「DNA通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。包含篩選標(biāo)記(SMG)和目的基因(G0I)的兩個(gè)T-DNA既可以通過(guò)單一農(nóng)桿菌株轉(zhuǎn)化(DaleyMetal,1998),也可以通過(guò)不同的農(nóng)桿菌株轉(zhuǎn)化(DepickerAetal,1985;McKnightTDetal,2987)。當(dāng)然，兩個(gè)T-DNA也可以整合到同一質(zhì)粒載體實(shí)現(xiàn)共轉(zhuǎn)化(KomariTetalz1996;MatthewsPRetalz2001),這些策略原理相同，但使丿U效果卻千差萬(wàn)別。A:單菌法單菌法是指分別將含有H的

5、基因和篩選標(biāo)記的兩個(gè)T-DNA構(gòu)建到不同或同一載體上，導(dǎo)入同一農(nóng)桿菌細(xì)胞并轉(zhuǎn)化。根據(jù)所用載體數(shù)目的不同又有不同的策略。B:雙載體一單菌株轉(zhuǎn)化所用的農(nóng)桿菌細(xì)胞含有2個(gè)載體，分別攜帶目的基因和篩選標(biāo)記。Daley等利用此方法獲得了無(wú)篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因油菜和煙草，其共轉(zhuǎn)化效率都在50%以上，且大部分報(bào)合基因組的不同位點(diǎn)。Miller等(2002)利用此方法轉(zhuǎn)化玉米，共轉(zhuǎn)化效率高達(dá)90%?？梢?jiàn)此方法獲得共轉(zhuǎn)化的效率非常高。C:單載體(雙T載體)一單菌株轉(zhuǎn)化所用的農(nóng)桿菌僅含有1個(gè)載體，其上包含有目的基因和篩選標(biāo)記的不同T-DNA區(qū)。Mattew

6、等利用此方法轉(zhuǎn)化大麥，共轉(zhuǎn)化效率高達(dá)66%,而其屮25%的共轉(zhuǎn)化植株后代出現(xiàn)了分離。C:混菌法混菌法是將含有H的基因和篩選標(biāo)記的兩個(gè)T-DNA構(gòu)建到不同的載體上并導(dǎo)入到不同的農(nóng)桿菌細(xì)胞，將這些農(nóng)桿菌以一定的比例混合轉(zhuǎn)化。這種轉(zhuǎn)化方法的轉(zhuǎn)化效率與菌液的恥比有關(guān)。Park等(2004)人以不同的比例混合菌液并轉(zhuǎn)化煙草，獲得共轉(zhuǎn)化植株的比率斧異顯著(0~54%).此外，混合菌株的特性也影響共轉(zhuǎn)化的效率。陸美芳等(2005)將兩個(gè)雙元載體分別導(dǎo)入到EHA105-AGL-l>EHA105和EHA105-LBA4404中檢測(cè)其共轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果發(fā)

7、現(xiàn)前兩纟R的共轉(zhuǎn)化效率相當(dāng)且明顯高于第三組，推測(cè)可能的原因?yàn)镋HA105和AGL-1的特性比較接近。研究表明，混菌法共轉(zhuǎn)化效率較單菌法低，而其中又以雙T載體的轉(zhuǎn)化效果為最好。Miller等在玉米屮比較了上述三種策略，發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)化的效率分別為93.4%、98.2%和11.7%。Chen等(2005)在比較了混菌法與雙T載體Z后也得出了相似的結(jié)論。然而，由于載體容量和酶切位點(diǎn)的限制，雙T載體構(gòu)建的難度很大，尤其是對(duì)大片段的目的基因。132基因槍介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化方法利用基因槍進(jìn)行共轉(zhuǎn)化一直不被人們重視主要是人們認(rèn)為基因槍介導(dǎo)的雙元載體的共轉(zhuǎn)化形

8、成單一位點(diǎn)重組，造成目的基因和篩選標(biāo)記連鎖，后代得不到分離的植株，此外，基因槍轟擊所形成的多拷貝問(wèn)題也一肓被人們所詬病。然而，利用基因槍進(jìn)行共轉(zhuǎn)化獲得無(wú)篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物也有報(bào)道，Rooke等(2003)人利用該方法成功的獲得了無(wú)篩