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《實(shí)驗(yàn)六細(xì)胞核和線粒體熒光觀察.ppt》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、實(shí)驗(yàn)六細(xì)胞核和線粒體的熒光觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)熒光顯微鏡的工作原理及使用方法了解熒光探針Rhodamine123和Hoechst33342與細(xì)胞成分的結(jié)合特性和光譜特性二、實(shí)驗(yàn)原理1.熒光顯微鏡細(xì)胞參量熒光探針吸收/發(fā)射nm特性DNA和RNAPropidumiodide(PI)535/617紅色熒光嵌入核酸雙鏈間,只能標(biāo)記死細(xì)胞.用于染色體,細(xì)胞觀察,分辨死活細(xì)胞和細(xì)胞周期研究Ethidiumbromide(EB)518/605紅色熒光嵌入核酸雙鏈間,只能標(biāo)記死細(xì)胞.用于電泳分析,染色體觀察DAPI358/461藍(lán)色熒光半通透細(xì)胞,結(jié)合于DNA的AT堿基對(duì).用于細(xì)胞周期的研究,染色體和
2、細(xì)胞核的觀察Hoechst33342350/461藍(lán)色熒光結(jié)合于DNA的AT堿基對(duì),可進(jìn)入活細(xì)胞,用于細(xì)胞周期的研究,染色體和細(xì)胞核的觀察蛋白和抗體的耦聯(lián)探針FITC494/518綠色熒光染死細(xì)胞,對(duì)PH值變化不敏感Texasred595/615紅色熒光多參量細(xì)胞標(biāo)記溶酶體Neutralred541/640紅色熒光探針微偏堿性,可標(biāo)記溶酶體等酸性細(xì)胞器線粒體Rhodamine123507/529黃綠色熒光可進(jìn)入活細(xì)胞,陽(yáng)離子性,攝入快,淬滅快,無(wú)毒性常用熒光探針介紹Hoechst33342和Rhodamine123Ho.33342是一種親脂性物質(zhì)，能與DNA特異性結(jié)合的熒光探針，所以被
3、大量用于活細(xì)胞的觀察和定量的研究。熒光激發(fā)和發(fā)射特性分別為350nm和461nm。羅丹明123是一種親脂性的陽(yáng)離子熒光探針。用它來(lái)標(biāo)記線粒體是由于線粒體的基質(zhì)對(duì)于膜間隙具有負(fù)電荷，而羅丹明123具有正電荷，二者電性相吸。所以能較好地觀察線粒體的形態(tài)變化。熒光激發(fā)和發(fā)射特性為507nm和529nm。三、儀器、材料與試劑儀器熒光顯微鏡，倒置顯微鏡材料A549、WI-38pc-3、載玻片，蓋片，滴管，濾紙?jiān)噭㏄BS緩沖液pH7.4Ho.33342儲(chǔ)存液:1mg/mL(溶于PBS)羅丹明123儲(chǔ)存液:1mg/mL(溶于甲醇)四、實(shí)驗(yàn)步驟1.將腫瘤細(xì)胞和正常組織細(xì)胞培養(yǎng)到小蓋玻片上2.配制Ho.
4、33342和羅丹明123工作液:Ho.33342(10μg/mL),羅丹明123(10μg/mL)（溶于PBS緩沖液，pH7.4）3.將蓋玻片上的細(xì)胞用PBS緩沖液輕輕漂洗2次4.在parafilm膜上分別滴加Ho.33342和羅丹明123工作液各10?L，將蓋玻片上的細(xì)胞倒扣在parafilm膜上室溫暗處孵育10min。5.在parafilm膜上加PBS緩沖液，待蓋玻片被沖起后，再輕輕揭下蓋玻片,用PBS緩沖液輕輕漂洗2次。6.利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核、線粒體。配制Ho.33342和羅丹明123工作液:Ho.33342(10μg/mL),羅丹明123(10μg/mL)（溶于PBS緩沖
5、液，pH7.4）將蓋玻片上的細(xì)胞用PBS緩沖液輕輕漂洗2次，分別滴加Ho.33342和羅丹明123工作液各10?L，室溫暗處孵育10min用PBS緩沖液輕輕漂洗2次，放在載玻片上制成的小室上利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核、線粒體實(shí)驗(yàn)步驟將腫瘤細(xì)胞和正常組織細(xì)胞培養(yǎng)到小蓋玻片上,至細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期思考題1.熒光顯微鏡的工作原理，及使用時(shí)應(yīng)注意的問題。2.細(xì)胞核的形態(tài)的變化與功能的關(guān)系
