6細(xì)胞核和線粒體的分離和觀察

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1、細(xì)胞核與線粒體的分級分離1.初步了解細(xì)胞內(nèi)各種成分的分離方法2、掌握差速離心方法細(xì)胞核和線粒體的分離方法3、對分離得到的細(xì)胞核及線粒體進(jìn)行活性鑒定。一、實驗?zāi)康募?xì)胞器分離基本步驟二、實驗原理細(xì)胞破碎分離、純化細(xì)胞器鑒定（一）細(xì)胞破碎的方法1.桿狀玻璃勻漿器法2.高速組織搗碎機(jī)法3.超聲波處理法4.化學(xué)裂介法5.反復(fù)凍融法二、實驗原理細(xì)胞破碎的注意事項：1、勻漿介質(zhì)：常用介質(zhì)是緩沖的蔗糖水溶液（0.25mol/L）。它比較近細(xì)胞質(zhì)的分散相，具有足夠滲透壓，防止顆粒膨脹破裂，對酶活性干擾小，在pH7.2-7.

2、4的條件下細(xì)胞器不易發(fā)生聚集。2、盡可能在低溫條件下進(jìn)行，避免酶失活。3、若是采用低滲方式破碎細(xì)胞，勻漿物在低滲溶液中的時間要越短越好，通常從開始收獲細(xì)胞到勻漿結(jié)束不要超過5分鐘。否則勻漿物在低滲溶液中時間太長，導(dǎo)致細(xì)胞器破裂，溶酶體酶泄漏，各種物質(zhì)降解。（二）分離純化的方法根據(jù)細(xì)胞器的大小、形狀、密度等物理特性差異，離心成為亞細(xì)胞組分分離過程中最廣泛應(yīng)用的技術(shù)離心是利用旋轉(zhuǎn)運動的離心力以及物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力密度的差異進(jìn)行分離、濃縮和提純的一種方法主要包括差速離心、密度梯度離心等方法。二、實驗原理差速離

3、心法根據(jù)顆粒大小和密度的不同存在的沉降速度差別，分級增加離心力，從試樣中依次分離出不同組分的方法。從低速到高速逐級沉淀分離，一般用于分離沉降系數(shù)相差較大（10倍及以上）的顆粒。優(yōu)點是：操作簡單，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子。缺點是：①分離效果差，不能一次得到純顆粒；須經(jīng)反復(fù)懸浮和離心加以純化。②壁效應(yīng)嚴(yán)重，特別是當(dāng)顆粒很大或濃度很高時，在離心管一側(cè)會出現(xiàn)沉淀；③顆粒被擠壓，離心力過大、離心時間過長會使顆粒變形、聚集而失活。密度梯度離心下次課講（三）細(xì)胞器的鑒定分析分析分

4、級分離得到的組分，可用細(xì)胞化學(xué)和生化方法進(jìn)行形態(tài)和功能鑒定。細(xì)胞器標(biāo)記酶的測定是評價細(xì)胞器內(nèi)膜組分和分離純度的主要依據(jù)，如線粒體內(nèi)膜上分布有細(xì)胞色素氧化酶，該酶使詹納斯綠B染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍(lán)綠色，從而使線粒體顯色，而胞質(zhì)中的染料被還原成無色。（也可使用羅丹明123或MitoTracker等熒光探針標(biāo)記法等）細(xì)胞核：DNA——亞甲基藍(lán)、甲苯胺藍(lán)、Hoechst染料等方法和步驟（一）細(xì)胞核的分離提取1、肝臟，剪成小塊(去除結(jié)締組織)盡快置于盛有0.9％NaCl的燒杯中，反復(fù)洗滌，盡量除去血污，用濾紙吸去

5、表面的液體。2、稱取肝組織1g，剪碎；用預(yù)冷的0.25mol／L蔗糖-0.05mol／LTris-HCI緩沖液，pH7.4（0.25mol／l蔗糖－0.003mol／l氯化鈣）溶液洗滌數(shù)次。3、按每克肝加8ml-9ml預(yù)冷的0.25mol／L蔗糖－0.05m/LTris-HCI溶液，用高速組織勻漿器勻漿（已完成）4、取一定量勻漿液，在0℃—4℃冰浴中用玻璃勻漿器將肝再次勻漿（勻漿器下端浸入盛有冰塊的器皿中，左手持之，右手將勻漿搗桿垂直插入管中，上下轉(zhuǎn)動研磨）——（因已事先勻漿，本步驟研磨次數(shù)和時間可縮短）

6、5、肝勻漿用雙層紗布過濾，濾液制一張涂片①,自然干燥.6、濾液以2500rpm，離心15分鐘；(1)緩緩取上清液，移入高速離心管中，保存于有冰塊的燒杯中，待分離線粒體用；(2)同時涂一張上清液片②做好標(biāo)記，自然干燥；(3)余下的沉淀物進(jìn)行下一步驟。7、用6ml蔗糖一Tris-HCI溶液懸浮沉淀物，以2500rpm離心15分鐘棄上清，將殘留液體用吸管吹打成懸液，滴一滴于干凈的載玻片上，涂片③，自然干燥。8、將①、②、③涂片用l％甲苯胺蘭（或亞甲基藍(lán)）染色后蓋片即可觀察。（二）高速離心分離提取線粒體1、將裝有

7、上清液的高速離心管，從裝有冰塊的燒杯中取出，配平后，以17000g離心20分鐘，棄上清，留取沉淀物。（本實驗用12000rpm,非冷凍離心）2、加入蔗糖-Tris-Hcl1ml，用吸管吹打成懸液，以17000g離心20分鐘，將上清吸入另一試管中，留取沉淀物，加入0.1ml蔗糖-Tris-Hcl氯化鈣溶液混勻成懸液(可用牙簽)。3、取上清液和沉淀物懸液，分別滴一滴于干凈載玻片上(分別標(biāo)記④、⑤涂片)，各滴一滴1％詹納斯綠b染液染20分鐘,蓋片觀察。4、油鏡觀察。注意事項1、各步驟加入的溶液的量需根據(jù)離心管的

8、大小自行調(diào)整。2、線粒體的染色必須先染色20分鐘后蓋蓋片，以便充分氧化。3、本實驗所有操作本應(yīng)在低溫下進(jìn)行，但實驗室的冷凍離心機(jī)損壞，用普通離心機(jī)離心，溫度和轉(zhuǎn)速都和實驗步驟有差別。實驗報告方法：按照實際的操作記錄結(jié)果：描述5張涂片鏡下情況討論：1、實際情況和理論預(yù)期是否符合？為什么？2、本實驗步驟有哪些可以改進(jìn)的地方？服務(wù)理念中的“點點”◆理解多一點真情濃一點◆學(xué)習(xí)勤一點品質(zhì)高一點◆理由少一點效率高一點◆處理問題靈活點工作過