線粒體的分離與觀察.doc

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1、實驗八線粒體的分離與觀察%1.教學目標：了解細胞勻漿和差速離心分級分離細胞組分的原理。了解提取線粒體的基本原理及其過程，通過光學顯微鏡的觀察了解體外分離的線粒體的一般形態(tài)，增加對線粒體的感性認識。掌握詹娜斯綠B染線粒體的方法。%1.重點：掌握用差速離心法分離動、植物細胞線粒體。掌握詹娜斯綠B染線粒體的方法。U!%1.難點：蔗糖密度梯度離心加樣操作技能。授課方式與教學方法：講解原理、實驗操作示范或具體指導(dǎo)。五.教學內(nèi)容：實驗原理制備線粒體采用組織勻漿在懸浮介質(zhì)屮進行差速離心。在一給定的離心場屮，球形顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的粘度。在均勻懸浮介質(zhì)屮離心一定

2、時間內(nèi)，組織勻漿中的各種cell器及其它內(nèi)食物，由于沉降速度不同將停留在不同的位置。細胞辭屮最先沉淀的是細胞核，其次是線粒體懸浮介質(zhì)通常用緩沖的蔗糖溶液，它比較接近細胞的分散相，在一定稈度上能保持細胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性。線粒體的鑒泄用詹納斯綠活染法，詹納斯綠B是對線粒體專一的活細胞染料毒性很小，屬于堿性染料，解離后帶正電，由此吸引堆積在線粒體膜上，線粒體cell色索氧化酶，使該料保持在氧化狀態(tài)，呈現(xiàn)藍綠色從而使線粒體顯色，而胞質(zhì)屮的染料被還原成無色。實驗步驟1.勻漿:取lg肝細胞，剪碎，加9ml、0.25ml/L緩沖蔗糖液勻漿（先加2nd勻漿，勻漿后再加7ml）,雙層尼龍

3、布過濾于10ml試管屮備用。2.差速離心:取lml0.34mol緩沖蔗糖液于2nd刻度離心管中（用滴管加至lml刻度即可）,然后沿管壁小心加入肝勻漿,約0.5ml覆蓋于上層,700Xg（3000rpm）離心10分鐘，棄沉淀取上清液，lOOOOXg仃2000rpm）離心10分鐘，沉淀為線粒體。3.染色：取線粒體沉淀涂片（注意勿A濃密），不待干即加1滴1%儈納斯綠B染色15min04.觀察：蓋上蓋玻片，顯微鏡觀察。（線粒體藍綠色，呈小棒狀或亞鈴狀。）實驗結(jié)果線粒體藍綠色,呈小棒狀或亞鈴:結(jié)果討論六.課堂小結(jié)根據(jù)學生的實驗結(jié)果進行總結(jié)。如果使用不帶冷凍控溫的普通高速離心機操作，

4、應(yīng)盡量縮短操作時間、注意樣品的冷凍,保持其生理活性。