線粒體膜分離--線粒體外膜-內(nèi)膜的分離.doc

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1、線粒體膜分離線粒體膜分離方法主要是密度梯度離心１.配液：(1)10mmol/LPBSpH7.4。(2)0.25mol/L蔗糖-10mmol/LTris-HCLpH7.4。(3)用10mmol/LTris-HCLpH7.4配制25.2%、37.7%、51.7%、61.5%(w/v)的蔗糖液。２.操作步驟全部操作在冰浴中進行，溶液須預冷。(1)純化的線粒體懸浮在10mmol/LPBS、pH7.4中膨脹20分鐘，再以g離心60分鐘，棄上清液，沉淀含內(nèi)外膜。沉淀重懸浮于0.25mol/L蔗糖-10mmol/LTris-HCLpH7.4中以

2、11500g離心15分鐘，上清液用于分離線粒體外膜，沉淀用于分離線粒體內(nèi)膜。(2)線粒體外膜的分離:①吸取上述上清液，以g離心60分鐘，棄上清沉淀重懸于適量的0.25mol/L蔗糖-10mmol/LTris-HCL溶液中。②用帶長針頭的注射器分別吸取3mL的25.2%、37.7%、51.7%蔗糖溶液，并以疊層鋪在超速離心管中，制備不連續(xù)的密度梯度。③吸取2mL樣品液小心加在25.2%蔗糖溶液的界面上。④以g離心45分鐘，線粒體外膜處在樣品液與25.2%蔗糖溶液的交界面上，用注射器收集線粒體外膜。(3)線粒體內(nèi)膜分離：①把11500

3、g離心15分鐘后的沉淀物重新置于適量的25.2%蔗糖溶液中。②用注射器吸取2ml的25.2%蔗糖溶液，另外分別吸取2.5mＬ的37.7%、51.7%、61.5%的蔗糖溶液，然后依次疊加超速離心管中，制成不連續(xù)的密度梯度。③吸取1.9mL樣品液，加在25.2%蔗糖溶液界面上，以77000g離心90分鐘，作第一次分離，在37.7%與51.7%蔗糖溶液界面下為內(nèi)膜區(qū)帶。④吸出內(nèi)膜區(qū)帶，加8倍體積蒸餾水并再次勻漿，然后以85000g離心30分鐘，棄上清液，沉淀懸浮在0.25mol/L蔗糖溶液中。⑤分別取7.5mL的37.7%、51.7%、

4、61.5%的蔗糖溶液，在離心管中制成不連續(xù)的密度梯度。⑥吸取初步分離的內(nèi)膜樣品液7.5ml加在37.7%蔗糖溶液的界面上。⑦以77000g離心90分鐘，作第二次分離，在51.7%蔗糖層中的上面區(qū)帶為線粒體內(nèi)膜，用注射器收集線粒體內(nèi)膜