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《骨骼肌核質(zhì)線粒體分離技術(shù)》由會員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、骨骼肌組織分離細(xì)胞核、胞漿、線粒體150mg脛前肌組織,置于已預(yù)冷的玻璃培養(yǎng)皿,用剪刀剪碎。2剪碎的組織加入300-500uLSTMbuffer,于冰上研磨1min以使均質(zhì)化(usingatight-fittingTeflonpestleattachétoapotterShomogenizersetto600-1000rpm),檢查組織是否已均勻化,若否,重做均質(zhì)化步驟。3均質(zhì)化組織加入離心管,冰浴30min,最大速度離心15秒,4℃。然后800g離心15分鐘。沉淀標(biāo)志為P0,上清S0。沉淀P04沉淀P0為細(xì)胞核和細(xì)胞碎片殘骸
2、。用300-500uLSTM溶液重懸,最大速度vortex15秒,500g離心15min。沉淀標(biāo)為P1,上清S1棄去。此時可以用顯微鏡檢測細(xì)胞核純度:取P1少量溶于臺盼藍(lán)溶液,放入血球計數(shù)器(haemocytometer)顯微鏡下檢測,若其中含有很多細(xì)胞碎片,則重復(fù)此步操作。5此步為提高P1的純度:將步驟4沉淀重懸于300-500uL的STM溶液,最大速vortex15秒,然后1000g離心15min,沉淀標(biāo)識為P5,上清S5棄去。6用200-500uL的NET重懸,用槍頭吹打至均勻(usingapipettetotritur
3、ateuntilhomogeneous),最大速vortex15秒,置冰上30min,該組分即含有nuclei組分,超聲(atahighsettingfor10-15swith30spauseswhilstbeingkeptonicethroughout.)9000g離心30分鐘,4℃。上清S6即為nuclearfraction。上清S07S0:cytosolicandmitochondrialfractions。離心800g,10min,上清S2保留,沉淀P2可棄去亦可與P0合并。8S211000g10min離心,上清S3(
4、包含cytosolandmicrosomalfraction)用冷的純(100%)丙酮在-20℃沉淀至少1小時后12000,5min。沉淀P7重懸于100-300ul的STMbuffer,標(biāo)志為cytosolicfraction,其中可能包含一些微粒體(microsomalcontent)。9沉淀P3重懸于100-200uL的STM,11000g離心10分鐘,沉淀P4為線粒體組分。該組分重懸于SOLbuffer,超聲(athighsetingfor5-10secondswith30secondpauses)標(biāo)志為mitocho
5、ndrialfraction。Buffers:STM:250mMsucrose50mMTris-HClpH7.45mMMgCl2ProteaseandphosphataseinhibitorcocktailsNETHEPESpH7.9MgCl20.5MEDTA0.2mMGlycerol20%Triton-X-1001%ProteaseandphosphataseinhibitorcocktailsSOLTrisHCl50mMpH6.8EDTA1mMTriton-X-1000.5%Proteaseandphosphatasein
6、hibitorcocktails文獻(xiàn):asimpleprotocolforthesubcellularfractionationofskeletalmusclecellsandtissue。