骨骼肌核質線粒體分離技術

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1、骨骼肌組織分離細胞核、胞漿、線粒體150mg脛前肌組織，置于已預冷的玻璃培養(yǎng)皿，用剪刀剪碎。2剪碎的組織加入300-500uLSTMbuffer，于冰上研磨1min以使均質化（usingatight-fittingTeflonpestleattachétoapotterShomogenizersetto600-1000rpm），檢查組織是否已均勻化，若否，重做均質化步驟。3均質化組織加入離心管，冰浴30min，最大速度離心15秒，4℃。然后800g離心15分鐘。沉淀標志為P0，上清S0。沉淀P04沉淀P0為細胞核和細胞碎片殘骸

2、。用300-500uLSTM溶液重懸，最大速度vortex15秒，500g離心15min。沉淀標為P1，上清S1棄去。此時可以用顯微鏡檢測細胞核純度：取P1少量溶于臺盼藍溶液，放入血球計數(shù)器（haemocytometer）顯微鏡下檢測，若其中含有很多細胞碎片，則重復此步操作。5此步為提高P1的純度：將步驟4沉淀重懸于300-500uL的STM溶液，最大速vortex15秒，然后1000g離心15min，沉淀標識為P5，上清S5棄去。6用200-500uL的NET重懸，用槍頭吹打至均勻（usingapipettetotritur

3、ateuntilhomogeneous），最大速vortex15秒，置冰上30min，該組分即含有nuclei組分，超聲（atahighsettingfor10-15swith30spauseswhilstbeingkeptonicethroughout.）9000g離心30分鐘，4℃。上清S6即為nuclearfraction。上清S07S0：cytosolicandmitochondrialfractions。離心800g，10min，上清S2保留，沉淀P2可棄去亦可與P0合并。8S211000g10min離心，上清S3（

4、包含cytosolandmicrosomalfraction）用冷的純（100%）丙酮在-20℃沉淀至少1小時后12000，5min。沉淀P7重懸于100-300ul的STMbuffer，標志為cytosolicfraction，其中可能包含一些微粒體（microsomalcontent）。9沉淀P3重懸于100-200uL的STM,11000g離心10分鐘，沉淀P4為線粒體組分。該組分重懸于SOLbuffer，超聲（athighsetingfor5-10secondswith30secondpauses）標志為mitocho

5、ndrialfraction。Buffers:STM:250mMsucrose50mMTris-HClpH7.45mMMgCl2ProteaseandphosphataseinhibitorcocktailsNETHEPESpH7.9MgCl20.5MEDTA0.2mMGlycerol20%Triton-X-1001%ProteaseandphosphataseinhibitorcocktailsSOLTrisHCl50mMpH6.8EDTA1mMTriton-X-1000.5%Proteaseandphosphatasein

6、hibitorcocktails文獻：asimpleprotocolforthesubcellularfractionationofskeletalmusclecellsandtissue。