測序結果分析.docx

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1、測序結果的判讀測序結果為.abi格式，可用軟件chrosmas打開，一種顏色的峰代表一個堿基，峰的高低表信號的強弱。一個正常的N表示機器沒法判讀是哪種堿基，原因是：雜峰的信號高于機器默認的值，機器會認為該處有兩個峰，因此不能判斷確定是哪個峰，需要人工判讀。以下三種情況會出現(xiàn)N：有雜合子，有雜峰，反應已結束。原因：測序產(chǎn)物純化不夠注意：染料峰位于序列的前?100?堿基以內(nèi);酒精峰位于序列的?220~320?堿基之間產(chǎn)生的原因是樣品或毛細管內(nèi)有灰塵等固體小顆粒原因：測序反應失敗。解決辦法：改進條件，重做反應。注意兩個關鍵因

2、素：引物與模板之間的比例：3.2pmol:200ng。模板DNA的純度和用量：1.6~2.0原因：殘余的Dye太多，純化不夠。有測序反應，但效率低下信號太弱解決辦法：純化充分。避開引物峰，確定新的分析起點1、PCR產(chǎn)物測序時出現(xiàn)重疊峰問題圖1(模板中有堿基缺失，往往是單一位點(1-1)或兩個位點(1-2)堿基缺失導致測序結果移碼)解決方法：將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒(如T載體)中挑單克隆測序，或?qū)CR產(chǎn)物進行PAGE純化(至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化)后再進行測序。問題圖2(PCR產(chǎn)物不純，含部分序列一致的兩種以上的片段

3、，長度不一)解決方法：主要原因是PCR產(chǎn)物沒有純化，含有部分序列一致的兩種以上長度不一的片段，將PCR產(chǎn)物進行PAGE純化(至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化)后再進行測序，便可解決。問題圖3(測序引物有堿基缺失)測序引物有堿基缺失(一般是引物的5'端缺失)，和模板的堿基缺失即圖1有些類似，所不同的是模板堿基缺失一般是在一段正常測序序列后才出現(xiàn)移碼，而引物堿基缺失的話，則從測序一開始就出現(xiàn)移碼，表面在圖形上便是一開始就是嚴重的峰形重疊。解決方法：重新合成引物，或?qū)⒁镞M行PAGE純化2、克隆測序時出現(xiàn)峰形重疊原因：所挑選的重

4、組子不是單克隆，所提供的測序用質(zhì)粒中含有兩種以上插入片段不同的質(zhì)粒；或是是送測序的菌液污染解決方法：重新挑單克隆的菌落(劃線分離單菌落)，提質(zhì)?；蛩途涸俅螠y序。3、樣品有雜合/突變位點模板中有雜合型突變，也就說模板本身在這個位點出現(xiàn)突變；或者是從基因組中擴增出來的雜合位點。如果模板有雜合(突變或缺失)，那么測序圖形中其他的位點一般都是單一的峰形，然后突然在某一個位點出現(xiàn)重疊峰(如圖中箭頭所示)。解決方法：建議將DNA片段克隆到載體再測序。4、polyA/T和C/Gcluster導致的套峰和測序信號衰減RACE測序時經(jīng)

5、常遇到圖4-1和圖4-4的情形，解決方法：從另一端測序；或者構建載體進行測序。5、基因中含有重復序列可能的原因:樣品中含有重復序列導致的測序結果和PolyA/T的結果一樣，會導致Frame滑動，較短的重復序列會導致測序結果出現(xiàn)移碼；而較長的重復序列會使定序信號衰減。解決辦法:反向測序有時能夠順利的通過重復序列區(qū)域(但不是一定都能夠)，通過多次的測序結果比對，拼接可以得到全序列結果。