如何分析測(cè)序結(jié)果.pptx

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1、軟件和文件用Sequencher軟件Demo版看序列，Demo版不能保存序列，但其實(shí)絕大部分時(shí)候并不需要保存，只要簡(jiǎn)單看一下測(cè)序結(jié)果是否正確即可，用這個(gè)軟件是最方便的。測(cè)序返回兩種格式的文件，ABI和SEQ。ABI是原始文件，SEQ是根據(jù)ABI結(jié)果導(dǎo)出的，未必完全正確，建議只看ABI，有需要再拿SEQ去修改、拼接。1、選擇同一個(gè)載體的所有測(cè)序ABI文件，拖拽到Sequencher窗口釋放即可導(dǎo)入序列文件2、在Sequencher窗口中雙擊序列文件打開(kāi)，可見(jiàn)序列質(zhì)量：藍(lán)色越深表示序列越不可信。2、點(diǎn)擊ShowChromatogram

2、可查看峰圖：不可信不可信可信3、因此，先把序列前后深藍(lán)色的部分都刪掉這一條序列可信的長(zhǎng)度只有880bp，而相應(yīng)的SEQ文件并沒(méi)有刪除前后不可信的序列，仍然給出了1225bp的長(zhǎng)度，因此不能用SEQ去判斷測(cè)序結(jié)果。同時(shí)，在可信的序列中仍然存在個(gè)別深藍(lán)色的堿基，這些堿基是否可信，也要根據(jù)峰圖自行判斷。4、所有序列都只留下可信區(qū)段之后，全選，點(diǎn)擊第二個(gè)按鈕AssembleAutomatically則可將序列比對(duì)到一起，形成一個(gè)Contig文件。4、Contig文件打開(kāi)就是下圖的overview形式，如果序列之間能連通，說(shuō)明目標(biāo)序列完整測(cè)

3、通了，如果有缺口則需要加測(cè)。要把Contig文件拆散重組，則點(diǎn)擊菜單欄的Contig→DissolveContig…即可4、第一個(gè)按鈕AssemblyParameters是調(diào)整比對(duì)的參數(shù)，右圖表示至少有85%相似性和20bp的overlap才能比對(duì)到一起，如果要比對(duì)引物且引物少于20bp，則要調(diào)低minimumoverlap的值；如果序列有某一段差異較大比對(duì)不上，也可調(diào)低minimummatchpercentage的值，但調(diào)得太低可能會(huì)比對(duì)到錯(cuò)誤的位置。5、點(diǎn)擊Bases按鈕，可查看具體的序列信息5、一個(gè)載體挑至少兩個(gè)克隆去測(cè)序，

4、兩個(gè)之間相互比，有不一樣的就會(huì)在底下出現(xiàn)一個(gè)點(diǎn)（按Ctrl+D可以快速定位到有點(diǎn)的地方），這些點(diǎn)就是需要我們自己判斷正誤的地方。以上兩個(gè)點(diǎn)的出現(xiàn)是由于測(cè)序質(zhì)量下降導(dǎo)致，因?yàn)樗臈l序列，1和2號(hào)克隆各測(cè)到兩次，其中三條序列一樣，說(shuō)明兩個(gè)克隆是相同的。左圖四個(gè)克隆中，第四個(gè)與另外三個(gè)不同，說(shuō)明第四個(gè)在PCR擴(kuò)增中有堿基錯(cuò)配。也有發(fā)生堿基缺失的、堿基插入的。以上出現(xiàn)差異的點(diǎn)都是位于淺藍(lán)色的可信區(qū)段，通常不會(huì)有讀峰錯(cuò)誤的問(wèn)題，可以不用理會(huì)峰圖。如果點(diǎn)出現(xiàn)在深藍(lán)色的區(qū)段，則要打開(kāi)峰圖自己解讀。如右圖，第三個(gè)克隆多了一個(gè)G，且此處是深藍(lán)色，表明

5、儀器對(duì)此處的解讀存在疑問(wèn)。打開(kāi)峰圖比較三個(gè)克隆的差異，發(fā)現(xiàn)第三個(gè)克隆在GG處的兩個(gè)峰拖得比較開(kāi)，導(dǎo)致儀器誤判為GGG，但又不及三個(gè)峰的寬度，原序列應(yīng)該是正確的GG。6、若需導(dǎo)入模板和引物進(jìn)行比對(duì)，可將模板和引物序列按以下格式保存在txt文檔中，直接將txt拖拽到Sequencher窗口釋放即可：>16666-NIP-gDNAATCGATCG……>16666-Pro-FATCGATCG……>16666-Pro-RATCGATCG……注意區(qū)別錯(cuò)配與SNP位點(diǎn)的差異！一個(gè)載體挑至少兩個(gè)克隆，如果它們之間有不一樣的位點(diǎn)，則說(shuō)明是PCR過(guò)程

6、中引入的錯(cuò)配，發(fā)生錯(cuò)配的克隆就不要用了。我們從HHZ中擴(kuò)出來(lái)的序列跟NIP比，會(huì)有很多SNP、InDels，表現(xiàn)為幾個(gè)克隆之間一模一樣，但都與NIP模板序列不一樣。