一株產(chǎn)低溫纖維素酶細(xì)菌的初步分析

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1、生物學(xué)通報(bào)2010年第45卷第8期一株產(chǎn)低溫纖維素酶細(xì)菌的初步分析侯進(jìn)慧孫會(huì)剛鄭寶剛田力蔡侃(徐州工程學(xué)院江蘇徐州221008)摘要從農(nóng)田、農(nóng)產(chǎn)品果實(shí)表面獲得的多株產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌中，篩選到一株產(chǎn)低溫纖維素酶活性較高的菌株T34，使用PCIL方法克隆到長(zhǎng)度為1419bp的16SrDNA序列。提交到美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心NCBI基因庫(kù)中，序列號(hào)是：FJ796222。利用生物信息學(xué)方法分析該序列，將該菌分類(lèi)為Baciflussp．。分析其產(chǎn)酶條件，發(fā)現(xiàn)其在20％2時(shí)產(chǎn)酶活性最高。關(guān)鍵詞纖維素酶低溫BaciHus中國(guó)圖書(shū)分類(lèi)號(hào)：Q55文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B纖維素是世界上最豐富的碳水化合物資源，但白

2、胨10g，酵母膏5g，NaC110g，去離子水定溶是由于這種由葡萄糖聚合而成的高分子化合物難至1L，滅菌備用。產(chǎn)纖維素酶菌株篩選培養(yǎng)基：于分解，加上目前研究獲得的纖維素酶活性都較羧甲基纖維素10g，蛋白胨1Og，酵母膏5g，低。并且不同種類(lèi)纖維素酶的最適條件也受到溫KH2PO41g，MgSO40．2g，NaC110g，葡萄糖2g，度、pH值等很多因素的限制，導(dǎo)致纖維素資源的利瓊脂12g，去離子水定溶至1L，滅菌備用。搖瓶用率一直處在很低的水平。對(duì)于秸稈等纖維素資源發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨1．0％、酵母粉1．0％、CMC的焚燒，既危害生態(tài)平衡，又會(huì)加重環(huán)境污染。如果1．O％、NaC10．5％

3、、KH2PO40．1％，滅菌后使用。采用生物的方法將這些纖維素資源轉(zhuǎn)化為可以利3)試劑藥品。實(shí)驗(yàn)常規(guī)的分析純生化試劑和用的葡萄糖．那么它們就可以作為單細(xì)胞蛋白質(zhì)、PCR反應(yīng)引物購(gòu)自于“上海生工生物工程技術(shù)服酒精、生物燃料的生產(chǎn)原料，對(duì)于解決食品短缺、環(huán)務(wù)有限公司”。境污染和能源危機(jī)等世界性難題都有著深遠(yuǎn)的意1．2產(chǎn)纖維素酶菌株篩選?將采集的樣品培義，這也符合科學(xué)發(fā)展觀和可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略。在養(yǎng)2～4d，然后將0．5％的剛果紅倒人培養(yǎng)基中染農(nóng)產(chǎn)品加工過(guò)程中，纖維素酶也有著廣泛應(yīng)用[1-2]。色5min，使用5％的NaC1溶液浸泡脫色1h。如本文從農(nóng)田、農(nóng)產(chǎn)品果實(shí)表面篩選到一株產(chǎn)低果菌落周

4、圍出現(xiàn)透明水解圈，則說(shuō)明該菌株產(chǎn)分溫纖維素酶活性較高的菌株T34，利用生物信息學(xué)泌性纖維素酶。手段分析其16SrDNA序列，對(duì)其進(jìn)行了鑒定。對(duì)1．3菌株形態(tài)分析分析菌落特征．在顯微鏡下產(chǎn)低溫纖維素酶菌株的分析，可擴(kuò)展纖維素資源的觀察細(xì)菌形態(tài)。利用范圍。對(duì)篩選的菌株進(jìn)行分類(lèi)，是研究產(chǎn)酶菌1．4菌株生長(zhǎng)情況分析將菌種接種到LB培養(yǎng)株的基礎(chǔ)工作，也是微生物檢驗(yàn)的必要程序，本文基，在28℃的搖床上．以180rpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行連續(xù)培的分析方法為相應(yīng)研究提供了有價(jià)值的參考。養(yǎng)，通過(guò)測(cè)量液體培養(yǎng)基中細(xì)菌的OD鯽值，確定1材料與方法菌株生長(zhǎng)狀況，制作生長(zhǎng)曲線。1．1實(shí)驗(yàn)材料1．5酶菌株的16SrDNA序

5、列分析提取菌株基1)菌株采集。本實(shí)驗(yàn)篩選到的產(chǎn)纖維素酶菌因組DNA[5]，根據(jù)細(xì)菌16SrDNA序列保守性設(shè)株分離自農(nóng)田土壤和農(nóng)產(chǎn)品果實(shí)表面。將采集的計(jì)通用引物：樣品在實(shí)驗(yàn)室中用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)現(xiàn)：AGAG1TGATCCTGGCTCAG涂布于LB固體培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培R：GGTTACCTrGTrACGACTT養(yǎng)長(zhǎng)出菌落后，再將菌落轉(zhuǎn)接到產(chǎn)纖維素酶菌株P(guān)CR反應(yīng)步驟是：①95％預(yù)變性5rain；②篩選培養(yǎng)基，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4d。94℃變性30S；~57~c退火60s；~72oc延伸90s，2)培養(yǎng)基1。LB(Lufia—Be~ani)培養(yǎng)基：胰蛋

6、重復(fù)步驟2～4，22個(gè)循環(huán)；⑤72~C延伸10rain?；痦?xiàng)目：徐州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(XZZD0924)，徐州工程學(xué)院校級(jí)科研項(xiàng)目(XKY2008110)2010年第45卷第8期生物學(xué)通報(bào)45PCR反應(yīng)擴(kuò)增出的16SrDNA片段送“上海生工2．2菌株T34生長(zhǎng)狀況通過(guò)連續(xù)測(cè)量液體培生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司”測(cè)序。將16SrDNA養(yǎng)基中菌株T34的OD鯽值，確定該菌在28~C的序列登錄到NCBI網(wǎng)站上，獲得基因序列號(hào)。使用生長(zhǎng)曲線(如圖2)。BLAST程序在GeneBank基因庫(kù)中比對(duì)序列，分析產(chǎn)酶菌株的分類(lèi)地位。1．6產(chǎn)酶條件分析以葡萄糖含量(mg／mL)為橫坐標(biāo)。以吸光度值為縱坐標(biāo)

7、，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Il9]。鍪使用羧甲基纖維素鈉作為底物，與3，5一二硝基水楊酸反應(yīng)．在540nm波長(zhǎng)下比色，根據(jù)A540nmO．5計(jì)算CMCase酶活力'7]。O2456789l0Il121314151617182結(jié)果時(shí)問(wèn)(h)2．1篩選到產(chǎn)低溫纖維素酶菌株通過(guò)實(shí)驗(yàn)，篩圖2菌株T34的生長(zhǎng)曲線選到5O多株產(chǎn)纖維素酶菌株。確定在低溫條件下2．316SrDNA分析通過(guò)8F和1492R2個(gè)引纖維素酶活性較高的菌株T34，其菌落分散分布，物雙向測(cè)序獲得菌株T34的1