條斑紫菜多糖對(duì)人肝癌bel7402抗腫瘤作用的初步研究

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1、中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)2010年第08期FoodandNutritioninChinaN0．08．2010條斑紫菜多糖對(duì)人肝癌Bel7402抗腫瘤作用的初步研究張杰，楊旭東，王崴(牡丹江醫(yī)學(xué)院，牡丹江157011；哈爾濱市中醫(yī)醫(yī)院，哈爾濱150076)摘要：目的：研究條斑紫菜多糖對(duì)人肝癌Be17402體外抗腫瘤作用。方法：采用MTT法觀察條斑紫菜多糖體外對(duì)肝癌Be17402的增殖抑制作用；熒光顯微鏡觀察不同濃度條斑紫菜多糖誘導(dǎo)Bel74O2細(xì)胞凋亡作用情況，PoT-PcR檢~]SurvivinBax基因表達(dá)量的變化。結(jié)果：條斑紫菜多糖對(duì)人肝癌Be174

2、02~l&有顯著地增殖抑制作用，能誘導(dǎo)Bel7402~胞凋亡，并且能上調(diào)Bax、降低Survivin表達(dá)。結(jié)論：條斑紫菜多糖體外有一定的抗腫瘤作用，并能促進(jìn)Be17402~J&凋亡，其機(jī)制可能與激活Bax、抑制Survivin表達(dá)有關(guān)。關(guān)鍵詞：條斑紫菜多糖；肝癌；Bax基因；Survivin基因條斑紫菜(Porphyrayezoens~)屬于紅藻門紅毛1X10個(gè)／ml，每~LlOOl接種于96孑L板中。每個(gè)劑量菜科，是一種高蛋白、低脂肪、營(yíng)養(yǎng)豐富的食用海設(shè)12個(gè)平行孔，分別培養(yǎng)12、24和48h后，加入5g／L藻。多糖作為其主要有效成分，具有降

3、血壓、抗疲MTT20l(調(diào)零組除外)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸棄上勞、抗腫瘤、提高免疫力¨’等生物學(xué)功能。已有研清液，每孑L加入150DMSO溶解樣品，采用酶標(biāo)儀究表明，條斑紫菜多糖有較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞增殖抑制測(cè)定各~L490nm(OD)值。比色時(shí)以RPMI一1640培養(yǎng)活性，但其抗肝癌的作用未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究條液調(diào)零。按公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(InhibitionRate，斑紫菜多糖對(duì)人肝癌Be17402體外抗腫瘤作用，并初步IR)。IR=(對(duì)照組OD一實(shí)驗(yàn)組OD)／(對(duì)照組OD．空探討其作用機(jī)制，為其藥用功效開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。白組OD)×100％。

4、2．3細(xì)胞凋亡檢測(cè)1實(shí)驗(yàn)材料取指數(shù)生長(zhǎng)期的癌細(xì)胞，加人適量0．25％胰蛋1．1細(xì)胞株白酶液消化細(xì)胞，使貼壁細(xì)胞脫落。用含10％胎牛人肝癌Be17402細(xì)胞株，由武漢中美科技有限公司血清的培養(yǎng)基制備成濃度為3X105個(gè)／m1的細(xì)胞懸提供。液，于6孔板中每孔接種1ml。將普通潔凈蓋玻片置1．2藥物、試劑與儀器于37℃、5％CO：培養(yǎng)箱。24h后加入不同濃度的條斑M(jìn)TT試劑，Trizol(Sigma公司)；引物核苷酸紫菜多糖；對(duì)照組加相同體積的培養(yǎng)液。48h后細(xì)胞片段，上海生工生物技術(shù)有限公司。熒光顯微鏡用胰酶消化，冷PBS(pH7．2)洗3遍，固定

5、液甲醇一冰醋(CKX41．F32FL，奧林巴斯)。酸(3：1)，4"C固定10min，棄固定液，蒸餾水洗3遍，室溫干燥，用5mg／LHoechst33258染色，37~C、2實(shí)驗(yàn)方法5％C0：培養(yǎng)箱中孵育15min，將孔中的蓋玻片取出，2．1細(xì)胞分組蓋在已滴好甘油的載玻片上，置于熒光顯微鏡上觀察實(shí)驗(yàn)組：用培養(yǎng)液倍比稀釋的4、8和16mg／ml的細(xì)胞形態(tài)并拍照。條斑紫菜多糖溶液。對(duì)照組：用含Be17402細(xì)胞的培養(yǎng)2．4RT-PCR測(cè)定Survivin、Bax表達(dá)液。設(shè)計(jì)引物如下：survivin~I物，上游：5-TTGGCA2．2MTTI；I／

6、,色法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率GGTGCCTGTTGAAT_3；下游：5一AGcCAGT收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腫瘤細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為cccCcAcAGcA-T．3，擴(kuò)增片段329bp。bax引物，作者簡(jiǎn)介：張杰(1977～)，女，山東省博興縣，碩士研究生，研究方向：中藥的藥理及毒理。張杰等：條斑紫菜多糖對(duì)人肝癌Be17402抗腫瘤作用的初步研究83上游：5一GTTTCATCCAGGATCGAGC一3；下游：5．GGAAGTCCAATGTCCAGC一3，擴(kuò)增片段345bP。p—actin引物，上游：5ATGTGGCACCACACCTTCTA．3，下游：5一C

7、GTCATACTCCTGCTTGCTG一3，擴(kuò)增片段838bp。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2min，94~C45s，55℃退火1min，72℃延伸lmin，35個(gè)循環(huán)，72℃復(fù)性5rain。圖1對(duì)照組(400×)經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析，分別計(jì)算Survivin、Bax與內(nèi)參擴(kuò)增帶熒光強(qiáng)度×面積的比值，得出Survivin、BaxmRNA的相對(duì)表達(dá)量。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析，通過Survivin／p—actin和Bax／p—actin的灰度比值作相對(duì)定量。2。5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(±S)表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11．5軟件，進(jìn)行t檢驗(yàn)。圖216mg／

8、ml條斑紫菜多糖組(400×)3結(jié)果3．3各組Survivin和Bax基因表達(dá)情況3．1對(duì)Bel7402_~1胞增殖的影響與對(duì)照組(0．69±0．05