轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的基本方法和應(yīng)用

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1、Vol.2004,24(2)上海實驗動物科學(xué)ShanghaiLaboraroryAnimalScience119轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的基本方法和應(yīng)用陳錫文,管敏強,吳步猛(溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心溫州325027)摘要簡要介紹了轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的基本方法總結(jié)了轉(zhuǎn)基因動物在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用例如基因表達和調(diào)控建立人類疾病模型基因治療用作生物反應(yīng)器異種器官移植動物品種改良等關(guān)鍵詞轉(zhuǎn)基因動物;技術(shù)中圖分類號Q95-33文獻標(biāo)識碼A文章編號1004-8448200402-0119-06轉(zhuǎn)基因動物是指以實驗方法導(dǎo)入外源基因在由于轉(zhuǎn)基因動物體系打破了自然繁殖中的

2、種間染色體組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動物隔離使基因能在種系關(guān)系很遠的機體間流動它動物轉(zhuǎn)基因的常規(guī)方法微注射方法早在1966年就已將對整個生命科學(xué)產(chǎn)生全局性影響因此轉(zhuǎn)基因動發(fā)明(lin,1966),而1974年Jaenish和Mintz應(yīng)用物技術(shù)在1991年第一次國際基因定位會議上被公認(rèn)顯微注射法在世界上首次成功地獲得了SV40-是遺傳學(xué)中繼連鎖分析體細(xì)胞遺傳和基因克隆之DNA轉(zhuǎn)基因小鼠1980年Gordon等將猿猴病毒后的第四代技術(shù)被列為生物學(xué)發(fā)展史上126年中SV和人單純皰疹病毒HSV的tkthgmidine第14個轉(zhuǎn)折點生物體細(xì)胞中

3、的DNA能精確合成40kinase基因整合后的質(zhì)粒直接注入到小鼠受精卵并防止被DNA酶降解是由于存在由限制酶與修飾酶原核中成功地培養(yǎng)出轉(zhuǎn)基因小鼠transgenic組成的生物屏障一般情況下限制酶能將外源mice,TGM1982年P(guān)almiter等人將大鼠的生長DNA切割并降解掉而細(xì)胞本身合成的DNA由于修激素基因?qū)胄∈笫芫训男墼酥蝎@得比普通飾酶的甲基化作用而避免了被限制酶降解從而保持小鼠生長速度快24倍體型大一倍的轉(zhuǎn)基因碩遺傳穩(wěn)定性但是偶然也會發(fā)生外源DNA幸免降鼠在隨后10年間相繼報道過轉(zhuǎn)基因兔綿羊豬解的情況使生物體產(chǎn)生小的變異轉(zhuǎn)基因

4、技術(shù)就魚昆蟲牛雞山羊大鼠等轉(zhuǎn)基因動物它是利用生物這一特性把外源基因注入細(xì)胞核而獲們作為生物醫(yī)學(xué)研究的模型用于疾病的病因發(fā)得符合要求的轉(zhuǎn)基因動物[1,59]病機理和治療等方面研究不僅在基礎(chǔ)也在臨床轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)主要有顯微注射技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄各學(xué)科日益得到廣泛應(yīng)用使人類對疾病的認(rèn)識大病毒技術(shù)胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)技術(shù)精子載體技術(shù)基大前進了一步[14]本文就轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)特點及因直接導(dǎo)入技術(shù)和體細(xì)胞核移植技術(shù)等轉(zhuǎn)基因技其應(yīng)用狀況等問題作一介紹術(shù)主要步驟包括目的基因的選擇應(yīng)視研究目的而定將重組基因轉(zhuǎn)入受精卵將轉(zhuǎn)入了外源基因的轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的特點和基本方法受精卵植入

5、同期發(fā)情的受體動物在植入前完成整合胚胎的檢測篩選建立ES細(xì)胞系對出生后轉(zhuǎn)基因動物是實驗動物學(xué)與分子生物學(xué)緊密結(jié)基因整合表達情況進行檢測對整合表達的轉(zhuǎn)合的成果,是在胚胎和重組DNA技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)上基因動物進行育種試驗建立由成功轉(zhuǎn)基因個體或產(chǎn)生的群體組建的轉(zhuǎn)基因系[1,2,10]1.1基因顯微注射技術(shù)收稿日期2004-03-15是目前最常用的建立轉(zhuǎn)基因動物的方法之一作者簡介陳錫文1966-男浙江溫州人實驗師研究方向?qū)嶒瀯游飳W(xué)利用顯微操作系統(tǒng)和顯微注射技術(shù)直接將重組DNA萬方數(shù)據(jù)120上海實驗動物科學(xué)ShanghaiLaboraroryAnimal

6、ScienceVol.2004,24(2)分子以微注射的方式導(dǎo)入單細(xì)胞卵的原核中再理論上是可能的在實際操作上也完全可行體細(xì)將它植入假孕母鼠使其發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物的一胞核移植制備轉(zhuǎn)基因動物步驟外源目的基因通種方法[1,2,]過脂質(zhì)體介導(dǎo)等方法轉(zhuǎn)染動物體細(xì)胞用DNA雜1.2逆轉(zhuǎn)錄病毒技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄病毒技術(shù)交等方法檢測選擇整合有外源目的基因的體細(xì)胞是利用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為目的基因載體通過感作核供體將供體核移植到去核卵母細(xì)胞進行動染早期胚胎細(xì)胞實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移產(chǎn)生嵌合體動物物克隆[1,5,10](chimericanimal)再經(jīng)過雜交篩選即可獲得上述幾種方法各具

7、有優(yōu)缺點顯微注射技術(shù)具轉(zhuǎn)基因動物逆轉(zhuǎn)錄病毒的整合并不影響宿主DNA有相對整合率較高操作簡便易于成功但外源序列的重排感染的復(fù)數(shù)容易調(diào)整每個卵大約有基因通常以多拷貝串聯(lián)的形式隨機整合這種異常10次整合的機會病毒染色體還能提供一個TAG分排列可能妨礙其表達的正常調(diào)節(jié)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染子加速覆蓋部位的迅速克隆這些特征使逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)的外源基因通常是單一位點單一拷貝整合病毒轉(zhuǎn)基因法用于研究隨機突變[1,2,4]整合通常發(fā)生在逆轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復(fù)區(qū)1.3胚胎干細(xì)胞技術(shù)LTR從而保證了外源基因結(jié)構(gòu)的完整性但整胚胎干細(xì)胞ES是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團分離合效率較低而且操

8、作比較繁瑣能被導(dǎo)入的基因出來的能在體外培養(yǎng)一種高度未分化的多發(fā)育潛大小有一定限制通常為10kb左右[1,2]能的細(xì)胞它與早期胚胎聚集或被注射到胚胎后能參與宿主胚胎的