肉桂酸-4-羥化酶基因及其啟動(dòng)子克隆與表達(dá)分析-論文.pdf

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1、·生物技術(shù)·北方園藝2o14(18)：122～127棟肉桂酸一4一羥化酶基因及其啟動(dòng)子克隆與表達(dá)分析王玉珍，陳桂信。，趙利，呂恃衡，潘東明，姜翠翠。(1

2、福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建福州350002；2．福建農(nóng)林大學(xué)園藝產(chǎn)品貯運(yùn)保鮮研究所，福建福州350002；3．福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，福建福州350013)摘要：以不同發(fā)育時(shí)期的捺果實(shí)為試材，采用兩步法逆轉(zhuǎn)錄與抑制PCR技術(shù)相結(jié)合的方法構(gòu)建均一化全長(zhǎng)cDNA文庫，篩選出一條編碼肉桂酸_4一羥化酶的全長(zhǎng)cDNA(命名為PsC4H)；采用APA-Walking技術(shù)，分離獲得該基因的啟動(dòng)子序列；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)該基

3、因在榛果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)動(dòng)態(tài)。結(jié)果表明：R(H基因全長(zhǎng)為1772bp，ORF(()penReadingFrame)為1515bp，編碼504個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為】45719．6，等電點(diǎn)為4．94，經(jīng)序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，PsC4H氨基酸序列與李屬果樹高度同源；經(jīng)PlantCare軟件預(yù)測(cè)，櫬PH基因的啟動(dòng)子除具有TATA／cAAT—box~l"，還含有G-box、HSE等特異作用元件；實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示，PsC4H在捺果實(shí)整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程中呈下調(diào)一上調(diào)的表達(dá)趨勢(shì)，其中在成熟果中表達(dá)量最高。關(guān)鍵詞：檫；肉桂酸～4一羥化酶；啟動(dòng)子；實(shí)時(shí)熒光定量PCR中圖分類號(hào)：Q943．2文獻(xiàn)

4、標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1001～一0009(2014)18-0122—06苯丙烷代謝途徑是從莽草酸途徑衍生的植物特有GIH是細(xì)胞色素P450(CYP450)單加氧酶超家族的次生代謝途徑，是植物最重要的次生代謝途徑之一。苯一員，它是第一個(gè)被鑒定的植物CYI450單加氧酶，也是丙烷代謝途徑包括木質(zhì)素合成途徑、黃酮類物質(zhì)合成途第一個(gè)既被克隆、又確定了功能的植物CYP450酶l1。]。徑和原花青素特異合成途徑，可以產(chǎn)生多種具有重要生植物受到輻射、機(jī)械損傷、誘導(dǎo)子誘導(dǎo)和真菌感染等刺理功能的多酚類次生物質(zhì)。苯丙氨酸解氨酶(PAL)和激時(shí)，H活性及基因表達(dá)發(fā)生變化，使其在苯丙烷代肉桂酸一4一羥化

5、酶(H)分別催化苯丙烷代謝途徑中的謝途徑中扮演著不同的角色一。目前，多種植物編碼合第1步和第2步反應(yīng)。H的底物和產(chǎn)物包括反式肉成肉桂酸一4一羥化酶的基因已被克隆，如擬南芥J、大桂酸和p．香豆酸都受到苯丙烷代謝途徑中PAl和其它豆、楊樹、油菜、杏、李㈨、柑橘等。酶的調(diào)控。PAI和H這2種酶通常以}辦同方式表該研究從已構(gòu)建好的含不同發(fā)育時(shí)期的櫬果實(shí)均達(dá)，但是協(xié)同機(jī)理還不確定，一化cDNA文庫中篩選得到一個(gè)(H全長(zhǎng)基因，對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析及啟動(dòng)子克隆，了解檫果實(shí)第一作者簡(jiǎn)介：王玉珍(1988-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣麡銱基因的結(jié)構(gòu)與功能，這對(duì)從分子水平上探討檫苯丙生物技

6、術(shù)。E-mail：wyzhenabcde@163．COiTI．烷類次生代謝途徑具有重要意義；采用熒光定量PCR技責(zé)任作者：陳桂信(1967一)，男，博士，副教授，研究方向?yàn)榉肿由镄g(shù)，分析PsC4H基因在檫果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模學(xué)與生物技術(shù)。E-mail：gui~nchen@126．COFI1．式，以期為進(jìn)一步研究該基閃的表達(dá)調(diào)控機(jī)理、改變表收稿日期：2014-04-25達(dá)活性奠定工作基礎(chǔ)。Abstract：TheorthogonaldesignwasusedtOoptimizeISSR-PCRamplificationsystemOnAnoectochilu,sro,rbur

7、ghiiinfourlevelsoffivefactors(DNAteInplate，gDNApolymerase，primer，咐，anddNTP)respectively，TheresultsshowedthatasuitableISSR-PCRreactionsystemwasestablished．namely25tzIreactionsystemcontai~ring40ngDNAtemplate，1．6OUT．a(chǎn)qDNApolymerase，0．80rmnol／I[)rimer，0．96nmlol／IdNTt，2．40mmol／IM．Inconclusion，this

8、establishedISSR—PCRreactionsystemprovideanavailableandreliablemethodforgeneticdiversityanalysisandgermplasmclssificatinofAnoectochilusrOrburghii．Keywortk：Anoectochilusroxburghii；ISSR-PCR；orthogonaldesign122北方園藝2014(18)：122～127·生物技術(shù)·1材料與方法倍，取1