碭山酥梨肉桂酸4-羥化酶基因克隆及表達分析

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4、究（項目編號：30771483）安徽省生物學(xué)重點學(xué)科建設(shè)項摘要苯丙烷途徑是植物特有的次生代謝途徑，也是植物三大次生代謝途徑之一。在維管植物中，苯丙烷途徑的終產(chǎn)物主要用于合成木質(zhì)部的木質(zhì)素單體和黃酮類物質(zhì)。肉桂酸4-羥化酶(Cinnamate4-hydroxylase,EC1.14.13.11)屬于細胞色素單加氧酶超家族中的CYP73A亞家族。C4H是公共苯丙烷途徑的第2個關(guān)鍵酶，在整個途徑中起著十分重要的作用。它催化反式肉桂酸的羥化反應(yīng)形成4-羥基肉桂酸。為研究碭山酥梨木質(zhì)素代謝過程中C4H的作用，本研究克隆碭山酥梨C4H的cDNA全長，并進行生物信息學(xué)、原核表達和實時熒光定量表達

5、分析；通過構(gòu)建其真核表達載體，進行C4H蛋白定位和遺傳轉(zhuǎn)化研究。以期為利用分子生物學(xué)技術(shù)調(diào)控梨木質(zhì)素的合成和石細胞的發(fā)育奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：（1）克隆碭山酥梨肉桂酸4-羥基化酶基因的全長cDNA序列，命名為PbC4H，GenBank登錄號為KF663548。PbC4H全長1764bp，具有1515bp的開放閱讀框(ORF)，編碼504個氨基酸。（2）生物信息學(xué)分析表明，PbC4H相對分子量為57.8kD，等電點(pI)為9.05。PbC4H與多個物種C4H編碼的氨基酸序列具有較高的同源性，說明其在進化過程中較為保守。結(jié)構(gòu)域分析表明，PbC4H具有跨膜結(jié)構(gòu)域和典型的細胞色素

6、P450結(jié)構(gòu)域特征。（3）實時熒光定量PCR檢測表明，在自然授粉酥梨果實發(fā)育過程中，PbC4H的相對表達量高峰期在31d和55d，出現(xiàn)在石細胞、木質(zhì)素含量高峰期之前。不同品種授粉導(dǎo)致PbC4H的相對表達量發(fā)生改變，其中碭山酥梨(♀)×圓黃(♂)果實中PbC4H表達量高峰期在花后31d和47d，碭山酥梨(♀)×鴨梨(♂)果實中PbC4H表達量高峰期在花后31d和79d。（4）構(gòu)建了PbC4H原核表達載體pET-32a-PbC4H，在大腸桿菌BL21菌株中誘導(dǎo)表達了PbC4H融合蛋白。（5）構(gòu)建了植物表達載體pCAMBIA1304-PbC4H和反義RNA表達載體pBI121-antiP

7、bC4H。瞬時表達pCAMBIA1304-PbC4H，發(fā)現(xiàn)PbC4H蛋白定位于細胞膜上。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法，轉(zhuǎn)化pCAMBIA1304-PbC4H重組質(zhì)粒到擬南芥c4h基因突變體中，轉(zhuǎn)化pBI121-antiPbC4H重組質(zhì)粒到野生型擬南芥(Col-0)中，并篩選得到轉(zhuǎn)基因植株。關(guān)鍵詞：碭山酥梨，石細胞，木質(zhì)素，C4H，表達分析，遺傳轉(zhuǎn)化IAbstractThephenylpropanoidpathway,oneofthreesecondarymetabolism