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1、第38卷第4期河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)Z．38No．42O10年7月JournalofHenanNormalUniversity(NaturalScience)July．2010文章編號(hào)：lOOO一2367(2010)04—0136—04德國小蠊Blag2的原核表達(dá)及其多克隆抗體的制備張紅緒，邢文會(huì)，劉丹丹，胡萍，楊萍。(1．河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453007；2．河南教育學(xué)院人口與生命科學(xué)系，鄭州450046；3．海我武生物科技有限公司，上海200233)摘要：利用RTPCR技術(shù)擴(kuò)增德國小蠊Blag2基因，將其克隆進(jìn)pET一41b載體．在大腸桿菌中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)
2、獲得GST—Blag2蛋白，SDS—PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物，得到相對(duì)分子量約74kDa的融合蛋白．通過親和層析法純化表達(dá)的GSTBlag2蛋白，并以此表達(dá)產(chǎn)物制成油SLN疫苗免疫新西蘭白兔，制備多克隆抗體．間接ELISA法測(cè)得抗體效價(jià)達(dá)到1：300000．Western印跡表明抗體有較高的特異性，可分別與GST-Blag2融合蛋白和德國小蠊變應(yīng)原浸提液反應(yīng)．Blag2在大腸桿菌中的成功表達(dá)及其多克隆抗體的制備，為德國小蠊過敏患者的診斷和治療提供了幫助．關(guān)鍵詞：Blag2；原核表達(dá)；多克隆抗體中圖分類號(hào)：Q813．2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A蜚蠊(cockroach)，俗稱蟑螂，屬于昆蟲綱，節(jié)肢動(dòng)物門
3、，蜚蠊目，是過敏性哮喘的主要致敏原之一，其排泄物、蟲卵、尸體、蛻皮、碎屑等經(jīng)吸入、接觸、食人等途徑進(jìn)入人體，從而引起過敏性哮喘1]]．目前，全國范圍內(nèi)蜚蠊的分布有上升趨勢(shì)，德國小蠊(Blattellagermanica)已成為室內(nèi)優(yōu)勢(shì)種之一，其體內(nèi)的主要致敏蛋白Blag2是引起哮喘的重要變應(yīng)原．本研究從德國小蠊體內(nèi)提取總RNA，以逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得Blag2基因片段，將該基因片段克隆到原核表達(dá)載體pET一41b中，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選，對(duì)重組載體進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序分析后，轉(zhuǎn)化進(jìn)E．coliBL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，成功表達(dá)了Blag2，并以此表達(dá)產(chǎn)物免疫新西蘭
4、白兔，制備出抗Blag2的多克隆抗體．1材料與方法1．1材料德國小蠊由上海市疾病預(yù)防控制中心提供；新西蘭白兔(寶山區(qū)羅涇飛達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng))；載體質(zhì)粒pET-41b，E．coliBI21(DE3)由中科院細(xì)胞所提供．RTPCR試劑盒(TOYOBO)；A型小量DNA片段快速膠回收試劑盒(博大泰克)；限制性內(nèi)切酶BamHI，XHolI，T4連接酶(TaKaRa)；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(Sigma)．1．2方法1．2．1德國小蠊浸提液的制備將德國小蠊禁食5h，一20。C凍存0．5h．無水乙醇浸泡1h，研磨后丙酮脫脂．用碳酸氫鹽一鹽水提取液浸提72h，過濾除菌后4℃保存．1．2．2重組質(zhì)粒
5、的構(gòu)建及陽性克隆的篩選設(shè)計(jì)特異性引物(上游引物：5’一gatcggatccgatgattggccta—aagctagt一3’；下游引物：5gatcctcgagttagacgctttctactgaacggc一3’)，引入限制性酶切位點(diǎn)BamHI和XHolI．通過PCR擴(kuò)增Blag2基因．PCR循環(huán)條件為：94℃變性50S；55℃退火1min；72℃延伸2min，共35個(gè)循環(huán)．PCR產(chǎn)物用1的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，膠回收試劑盒回收．?dāng)U增的Blag2基因和表達(dá)載體pET一41b分別用BamHI和XHolI進(jìn)行雙酶切，膠回收試劑盒回收，用T4連接酶4℃連接過夜，并轉(zhuǎn)化至E．coli收稿日期：20
6、10—01—10基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(0624410030)；河南省動(dòng)物重點(diǎn)學(xué)科資助作者簡(jiǎn)介：張紅緒(1955一)，男，河南洛陽人，河南師范大學(xué)教授，主要從事哺乳類動(dòng)物癌前病變分子機(jī)理的研究第4期張紅緒等：德國小蠊Blag2的原核表達(dá)及其多克隆抗體的制備137BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞．挑取陽性克隆擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，用BamHI和XHolI進(jìn)行雙酶切鑒定后測(cè)序．1．2．3重組克隆在E．coliBL21(DE3)中的表達(dá)及純化空太小挑取陽性克隆接種在含Kan+的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0．6～1．0時(shí)，加入IPTG(終濃度為lmmol／L)誘導(dǎo)表達(dá)，分別于誘導(dǎo)0
7、、1、2、3、4h時(shí)分別取樣，12SDS-PAGE分析蛋白的表達(dá)，以空載體轉(zhuǎn)化E．coliBL21(DE3)作為陰性對(duì)照，于誘導(dǎo)0、4h取樣．將收集到的菌體超聲破菌后，lO000r／rain離心5rain，取沉淀用2M尿素洗滌，并用8M尿素變性，經(jīng)Ni親和層析柱純化后用于制備多抗．1．2．4免疫動(dòng)物空太小初次免疫時(shí)取100肛g純化的Blag2與等體積的弗氏完全佐劑乳化，皮下多點(diǎn)注射．初次免疫2周后，進(jìn)行第二次免疫，取100ptg純化的Blag2
