復氧導致的乳鼠心肌細胞凋亡的影響.pdf

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1、中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志2015年4月第13卷第4期二甲雙胍對缺氧／復氧導致的乳鼠心肌細胞凋亡的影響白鵬’，朱國斌，魯謙’，邊云飛。，周榮摘要：目的通過建立乳鼠心肌細胞缺氧／復氧損傷模型，觀察二甲雙胍對乳鼠心肌細胞凋亡的影響。方法選用原代培養(yǎng)72h的乳鼠心肌細胞，隨機分為4組：空白對照組、二甲雙胍組、缺氧／復氧組、二甲雙胍+缺氧／復氧組。流式細胞術(shù)檢測各組細胞的凋亡率，熒光定量PCR檢測各組細胞caspase一3mRNA表達，酶聯(lián)免疫法檢測各組細胞胞漿內(nèi)細胞色素C(CytC)的含量。結(jié)果與空白對照組相比，缺氧／復氧組細胞凋亡、caspase一3mRNA表達、胞漿CytC的含量均明顯增高

2、(P<0．05)。與缺氧／復氧組相比，二甲雙胍+缺氧／復氧組細胞凋亡率、caspase一3mRNA表達、CytC含量均明顯降低(P<0．05)。結(jié)論二甲雙胍可以抑制caspase一3表達，進而減輕缺氧／復氧所致的心肌細胞凋亡，其機制可能與抑制mPTP的開放，減少線粒體內(nèi)CytC的釋放有關(guān)。關(guān)鍵詞：二甲雙胍；心肌細胞；缺氧／復氧；凋亡；caspase一3；細胞色素C中圖分類號：R3~92文獻標識碼：Adoi：1&396~j，issn，1672—1349．2015．04．024文章編號：1672—1349(2015)04一O487—04心肌缺血再灌注損傷(MIRI)機制比較復雜，目前1．2

3、主要試劑Metformin(Sigma)DMEM培養(yǎng)基(武的研究涉及多個環(huán)節(jié)，包括再灌注誘發(fā)的活性氧漢博士德)胎牛血清(四季青)Ⅱ型膠原酶(Sigma)、(ROS)大暴發(fā)、細胞內(nèi)鈣超載、炎癥反應(yīng)、能量代謝障0．25％胰蛋白酶(Solarbio)，兔抗鼠0：一肌動蛋白工抗礙、細胞凋亡等機制有關(guān)[1]。其中細胞凋亡可能是及FITC羊抗兔Ⅱ抗(武漢博士德)；RNA抽提試劑盒、MIRI發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié)，所以抑制心肌細胞凋亡逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)；AnnexinV—FITC流式是減輕缺血再灌注損傷的一個重要方面。二甲雙胍檢測試劑盒(上海凱基生物公司)，Cytc測試試劑盒(metfo

4、rmin)是臨床上廣泛應(yīng)用于治療2型糖尿病的(上海西塘公司)。藥物。一項英國前瞻性糖尿病研究(UKPDS34)顯示1．3方法單獨給予二甲雙胍治療組與傳統(tǒng)治療(飲食控制)組相1．3．1乳鼠心肌細胞培養(yǎng)選取SD乳鼠，75酒精比，糖尿病患者大血管疾病的發(fā)生率下降了30％，急浸泡約1min，沿著左腋窩下剪開胸骨，取出心臟，置于性心肌梗死的發(fā)生率下降了39％；與磺脲類、胰島素預冷的PBS中，洗去血污，剝離心房、血管后分離出心治療組相比，在同等程度的血糖控制下，二甲雙胍組在室，眼科剪剪成1mm×1mm×1mm小塊，加入59／6降低終點死亡率、全因死亡率更加有效。這些研究的胰酶5mL～6mL緩慢吹打

5、消化約4min，靜置待沉顯示二甲雙胍除了降糖作用外，還具有額外的心血管淀后去掉上清液。向沉淀中加入0．1的膠原酶Ⅱ緩保護作用。進一步研究認為二甲雙胍具有改善能量代慢吹打消化3min，自然沉淀后將上清液加入含血清的謝、抗炎、改善內(nèi)皮功能等作用L3～。近年發(fā)現(xiàn)，二甲雙培養(yǎng)基中中止消化。重復上述步驟2次～3次，直至胍對心肌缺血再灌注損傷也具有保護作用_5]。但這種組織消化完全。將收集的細胞以1000r／min離心10保護作用是否與減輕心肌細胞凋亡有關(guān)，目前相關(guān)研min，棄上清，加入2O的培養(yǎng)液重懸細胞，差速貼壁究較少。本實驗通過體外培養(yǎng)建立心肌細胞缺氧／復法去除成纖維細胞。收集上清液，細胞懸

6、液中加入氧(H／R)模型，模擬心肌缺血再灌注，觀察二甲雙胍作5一Brdu至終濃度為0．1mmol／L以抑制非心室肌細胞用于心肌細胞后對缺氧／復氧導致的心肌細胞凋亡的生長，以約1×10／cm。的密度接種于6孔培養(yǎng)板，繼影響，并初步探討其相關(guān)機制。續(xù)培養(yǎng)48h后更換培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下觀察。1材料與方法1．3-2原代心肌細胞的鑒定針對胞漿中a一肌動蛋1．1實驗動物新生Sprague—Dawley(SD)大鼠，1白，采用兔抗鼠0t一肌動蛋白I抗和FITC一羊抗兔熒光d～3d齡，雌雄不限，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心Ⅱ抗，通過熒光法鑒定心肌細胞。提供。1．3．3心肌細胞H／R損傷模型的建立采用E

7、sumi等的實驗方法，配制缺氧液和復氧液。缺氧液組成：NaCI137mmol／L，KCl12mmOl／L，MgCl20．49mmOI，L，作者單位：1．山西醫(yī)科大學(太原030001)；2．山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院CaCl20．9mmol／L，HEPES4mmol／L，脫氧葡萄糖10通訊作者：朱國斌，E—mail；baipeng2011@126．commmoI／L，乳酸鈉20mmoI／L，pH6．2；復氧液組成：NaCJ·488·CHINESEJO