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1、磁珠分離技術(shù)一、原理免疫磁珠法分離細胞基于細胞表面抗原能與連接在磁珠上的特異性單抗相結(jié)合，在外磁場中，通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細胞由于不能與相連著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細胞得以分離。免疫磁珠法分正選法和負選法，也稱陽性分選法和陰性分選法。正選法-磁珠結(jié)合的細胞就是所要分離獲得的細胞；負選法-磁珠結(jié)合的細胞為不需要細胞。一般負選法分選較為常見，因為此方法獲得的所需要的細胞表面不含有抗體及磁珠的干擾?，F(xiàn)以兩步法分選小鼠CD4+CD25+T細胞的分選為例分別介紹負選法、正選法如下。1、材料試劑：<1>、生物
2、素化的，小鼠CD4陰性分選抗體混合物[cocktail，內(nèi)含抗B細胞（CD45R，B220）、CD8+T細胞（CD8a，Ly-2）、造血細胞（CD11b,Mac-1），NK細胞（CD49b,DX5）等非CD4+T細胞表面標志的抗體]。<2>、結(jié)合有磁珠的抗生物素抗體（Scimall科學(xué)在線提供）；含0.5%BSA（或0.5%FCS）及2mmol/LEDTA的PBS緩沖液；抗小鼠CD25-PE抗體；結(jié)合有磁珠的抗PE抗體（Scimall科學(xué)在線提供）；磁珠分離器或分離柱。2、實驗步驟<1>、負性分選小鼠CD4+T細胞取小鼠脾細胞，制成單細胞懸液加入生物素化的、不針對CD4
3、的抗小鼠抗體混合物加入PBS緩沖液及結(jié)合有磁珠的抗生物素抗體用MACS儀器，選擇適當(dāng)?shù)姆诌x程序，取陰性部分，即為CD4+T細胞PBS洗滌、重懸PBS洗滌、重懸4℃孵育15min4℃孵育10minPBS緩沖液洗滌兩次，重懸<2>、陽性分選小鼠CD25+T細胞收取上述分選的CD4+Ｔ細胞，制成單細胞懸液加入PE標記的抗CD25直接加結(jié)合有磁珠的抗PE抗體用MACS儀器,選擇適當(dāng)?shù)姆诌x程序,收取陽性部分,即為CD25+CD25+T細胞PBS洗滌、重懸PBS洗滌、重懸4℃孵育15-20min4℃孵育15-20minPBS洗滌、重懸二、注意事項：1、如果分離細胞用作培養(yǎng)，全過程注
4、意無菌操作。2、磁珠分離系統(tǒng)分離的細胞純度可以達到80%-99%，得率在60%-90%左右，僅次于或相當(dāng)于流式細胞儀的分選效率，與FACS相比，MACS設(shè)備簡單，耗時極短，故而應(yīng)用廣泛。設(shè)定不同的程序（細胞得率或純度不可兼得），連續(xù)兩次過柱分選可進一步提高分選細胞純度，通?？蛇_到95%-95%。3、由于陽性分選得到的細胞表面結(jié)合有抗體及磁珠，有可能影響細胞的功能，故目前常用陰性分選的方法分離細胞。如果只能用陽性分離的方法，Scimall科學(xué)在線建議在分離后培養(yǎng)1-2天，使結(jié)合在細胞表面的抗體脫落。4、抗體包被磁珠對死細胞、紅細胞常有非特異性結(jié)合。故而分選前去除死細胞、紅
5、細胞（如通過Ficoll分離去除）可以提高分離的效果。三、陽性分選法和陰性分選法的優(yōu)缺點比較優(yōu)缺點陽性分選法陰性分選法優(yōu)點1、只需要一種抗體；2、分離出的細胞純度高；3、對于比例小的細胞群，正選容易得到高純度。1、需要的細胞沒有被抗體等標記2、對需要的細胞，不需要特異性的細胞標記缺點1、需要特異性的靶細胞標記2、可能引起細胞活化需要多種抗體標記不需要的細胞
