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《免疫磁珠分離技術(shù)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、磁珠分離技術(shù)一、原理免疫磁珠法分離細(xì)胞基于細(xì)胞表面抗原能與連接在磁珠上的特異性單抗相結(jié)合，在外磁場(chǎng)中，通過(guò)抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，無(wú)該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與相連著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒(méi)有磁性，不在磁場(chǎng)中停留，從而使細(xì)胞得以分離。免疫磁珠法分正選法和負(fù)選法，也稱(chēng)陽(yáng)性分選法和陰性分選法。正選法-磁珠結(jié)合的細(xì)胞就是所要分離獲得的細(xì)胞；負(fù)選法-磁珠結(jié)合的細(xì)胞為不需要細(xì)胞。一般負(fù)選法分選較為常見(jiàn)，因?yàn)榇朔椒ǐ@得的所需要的細(xì)胞表面不含有抗體及磁珠的干擾?，F(xiàn)以兩步法分選小鼠CD4+CD25+T細(xì)胞的分選為例分別介紹負(fù)選法、正選法如下。1、材料試劑：<1
2、>、生物素化的，小鼠CD4陰性分選抗體混合物[cocktail，內(nèi)含抗B細(xì)胞（CD45R，B220）、CD8+T細(xì)胞（CD8a，Ly-2）、造血細(xì)胞（CD11b,Mac-1），NK細(xì)胞（CD49b,DX5）等非CD4+T細(xì)胞表面標(biāo)志的抗體]。<2>、結(jié)合有磁珠的抗生物素抗體（Scimall科學(xué)在線提供）；含0.5%BSA（或0.5%FCS）及2mmol/LEDTA的PBS緩沖液；抗小鼠CD25-PE抗體；結(jié)合有磁珠的抗PE抗體（Scimall科學(xué)在線提供）；磁珠分離器或分離柱。2、實(shí)驗(yàn)步驟<1>、負(fù)性分選小鼠CD4+T細(xì)胞取小鼠脾細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液加入生物素化
3、的、不針對(duì)CD4的抗小鼠抗體混合物加入PBS緩沖液及結(jié)合有磁珠的抗生物素抗體用MACS儀器，選擇適當(dāng)?shù)姆诌x程序，取陰性部分，即為CD4+T細(xì)胞PBS洗滌、重懸PBS洗滌、重懸4℃孵育15min4℃孵育10minPBS緩沖液洗滌兩次，重懸<2>、陽(yáng)性分選小鼠CD25+T細(xì)胞收取上述分選的CD4+Ｔ細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液加入PE標(biāo)記的抗CD25直接加結(jié)合有磁珠的抗PE抗體用MACS儀器,選擇適當(dāng)?shù)姆诌x程序,收取陽(yáng)性部分,即為CD25+CD25+T細(xì)胞PBS洗滌、重懸PBS洗滌、重懸4℃孵育15-20min4℃孵育15-20minPBS洗滌、重懸二、注意事項(xiàng)：1、如果分
4、離細(xì)胞用作培養(yǎng)，全過(guò)程注意無(wú)菌操作。2、磁珠分離系統(tǒng)分離的細(xì)胞純度可以達(dá)到80%-99%，得率在60%-90%左右，僅次于或相當(dāng)于流式細(xì)胞儀的分選效率，與FACS相比，MACS設(shè)備簡(jiǎn)單，耗時(shí)極短，故而應(yīng)用廣泛。設(shè)定不同的程序（細(xì)胞得率或純度不可兼得），連續(xù)兩次過(guò)柱分選可進(jìn)一步提高分選細(xì)胞純度，通?？蛇_(dá)到95%-95%。3、由于陽(yáng)性分選得到的細(xì)胞表面結(jié)合有抗體及磁珠，有可能影響細(xì)胞的功能，故目前常用陰性分選的方法分離細(xì)胞。如果只能用陽(yáng)性分離的方法，Scimall科學(xué)在線建議在分離后培養(yǎng)1-2天，使結(jié)合在細(xì)胞表面的抗體脫落。4、抗體包被磁珠對(duì)死細(xì)胞、紅細(xì)胞常有非特異
5、性結(jié)合。故而分選前去除死細(xì)胞、紅細(xì)胞（如通過(guò)Ficoll分離去除）可以提高分離的效果。三、陽(yáng)性分選法和陰性分選法的優(yōu)缺點(diǎn)比較優(yōu)缺點(diǎn)陽(yáng)性分選法陰性分選法優(yōu)點(diǎn)1、只需要一種抗體；2、分離出的細(xì)胞純度高；3、對(duì)于比例小的細(xì)胞群，正選容易得到高純度。1、需要的細(xì)胞沒(méi)有被抗體等標(biāo)記2、對(duì)需要的細(xì)胞，不需要特異性的細(xì)胞標(biāo)記缺點(diǎn)1、需要特異性的靶細(xì)胞標(biāo)記2、可能引起細(xì)胞活化需要多種抗體標(biāo)記不需要的細(xì)胞
