免疫磁珠法分離和提純雪旺細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究論文

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1、免疫磁珠法分離和提純雪旺細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究論文黃明羅卓荊肖偉張強(qiáng)【摘要】［目的］探討利用免疫磁珠從SD大鼠坐骨神經(jīng)分離培養(yǎng)獲得大量、高純度雪旺細(xì)胞的方法。［方法］選用4～7dSD大鼠，無菌條件下取雙側(cè)坐骨神經(jīng)，解剖鏡下剝離去除神經(jīng)外膜，獲得神經(jīng)束，將神經(jīng)束剪碎至1mm3大小。采用雙酶2次消化法消化，胎牛血清中止消化后，離心并加入DF12培養(yǎng)液培養(yǎng)。7d后應(yīng)用免疫磁珠法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化培養(yǎng)，培養(yǎng)2d后進(jìn)行傳代接種。培養(yǎng)過程中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、計(jì)數(shù)及活力測(cè)定；MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線.freelethodtoobtainSchneassivelyandpu

2、relybyimmunomagicheadsmethod.［Method］SDratsthathadbeenbornicroscopethenervefasciclesandtheepineuriumpuritycell.Thenthenervetractallparticleabout1mm3.Tes(0.25%trypsinaseand0.2%collagenaseⅠ)ensttostoptheprocessofdigestion,centrifugate(1000r/min,5min)andDF12culturemediummunomagich

3、eads.DuringtheicroscopandvitalforceofSchmunofluorescenttestandrecordthepurity.［Result］ThecellseparatedfromtheSDrat'ssciaticnerveandculturedinincubatoredasSchmunomagicheadscanbeusedtopurifytheSchethodcanobtainmassivepurifiednormalschmunomagicheads;sciaticnerve雪旺細(xì)胞（Schaagiccellso

4、rting，德諾DYNA公司)，細(xì)胞磁性分離器（德諾DYNA公司）。MouseAntip75LNGFr（武漢博士德）。SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德）。MTT（Gibco）。DMSO(Gibco)。消化用酶0.25％的胰蛋白酶（Sigma）和0.2％的Ⅰ型膠原酶（Gibco）。儀器倒置相差顯微鏡（NIKON,TE2000E）,解剖鏡，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（蒙雷，芬蘭）。1.2細(xì)胞分離脫頸法處死仔鼠，75％酒精浸泡消毒10min，Dhanks′液沖洗。切開股骨干后外側(cè)皮膚，更換器械后，取雙側(cè)坐骨神經(jīng)（長(zhǎng)約1cm），置于已加入Dhanks′液的培養(yǎng)

5、皿中。16倍解剖鏡下剝除神經(jīng)外膜，分離得到神經(jīng)束。Dhanks′液漂洗3次，每次0.5min。剪成1mm3左右的碎塊，用吸管將其移至離心管中。加入0.25％的胰蛋白酶和1ml0.2％的Ⅰ型膠原酶,37℃混合消化約30～40min，吸棄上清液，再加入0.2％的Ⅰ型膠原酶4ml，37℃消化約50～60min，消化過程中每隔20min振蕩消化液一次以利于消化。消化結(jié)束后，利用火焰拋光的玻璃吸管小心進(jìn)行機(jī)械吹打，直至溶液呈混懸狀，無明顯肉眼可見組織。1000r/min離心5min，吸棄上清并加入DF12培養(yǎng)液4ml（含體積分?jǐn)?shù)為20％胎牛血清）終止消化，再

6、次1000r/min離心5min，吸棄上清，加入DF12培養(yǎng)液4ml(含體積分?jǐn)?shù)為20％的胎牛血清)吹打混勻，計(jì)數(shù)后將濃度為2×105/ml的細(xì)胞懸液接種于塑料細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2孵箱中37℃培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每24h觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況。1.3細(xì)胞純化細(xì)胞接種后第7～10d，吸棄培養(yǎng)液，加入0.25％的胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液4ml，而后加入MouseAntip75LNGFr100μl，37℃培養(yǎng)，10min后加入200μl免疫磁珠（標(biāo)記羊抗鼠IgG），37℃培養(yǎng)15min后，置于磁性分離器上，吸去上清，加入DF12培養(yǎng)液5ml

7、(含體積分?jǐn)?shù)為20％的胎牛血清)，5％CO237℃培養(yǎng)24h后,再置于磁性分離器上，分析上清。目的細(xì)胞在上清液中，移至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)2d后即可進(jìn)行傳代。吸棄培養(yǎng)液，PBS液清洗1次，0.25％的胰蛋白酶室溫（24℃）消化，約30s后可見細(xì)胞突起收縮，胞體變圓，立即加入DF12培養(yǎng)液4ml(含體積分?jǐn)?shù)為20％的胎牛血清)終止消化。1000r/min離心5min，吸棄上清，加入DF12培養(yǎng)液4ml(含體積分?jǐn)?shù)為20％的胎牛血清)吹打混勻，計(jì)數(shù)后按3～5×105/ml的細(xì)胞濃度傳代。1.4細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)過程中每2

8、4h顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。在細(xì)胞接種及傳代前均進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)方法：取待測(cè)細(xì)胞懸液0.1ml，加入