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《麻類(lèi)脫膠高效菌株果膠裂解酶基因克隆與表達(dá).pdf》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫(kù)。
1、微生物學(xué)通報(bào)Aug.20,2013,40(8):1403—1413MicrobiologyChina◎2013byInstituteofMicrobiology.CAStongbao@im.a(chǎn)c.cn麻類(lèi)脫膠高效菌株果膠裂解酶基因克隆與表達(dá)成莉鳳劉正初段盛文馮湘沅鄭科鄭霞程毅(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所湖南長(zhǎng)沙410205)摘要:【目的】克隆麻類(lèi)脫膠高效菌株Dickeyasp.DCE一01的果膠裂解酶基因并進(jìn)行原核表達(dá),對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化和酶學(xué)性質(zhì)研究?!痉椒ā扛鶕?jù)該菌株全基因組序列預(yù)測(cè)的果膠裂解酶基因Q59419設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增后將該基
2、因連接到pEASY-E1和pACYCDuet一1載體上,導(dǎo)入E.coliBL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)。選擇酶活力高的陽(yáng)性克隆子進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)后,采用超濾和SephadexG—lo0凝膠層析兩步法純化出果膠裂解酶,研究其酶學(xué)性質(zhì)。【結(jié)果】克隆到果膠裂解酶基因pel(GenBank登錄號(hào):JX964997),其序列全長(zhǎng)1128bp,編碼375個(gè)氨基酸。pACYCDuet一1-pel-BL表達(dá)胞外果膠裂解酶活力最高,發(fā)酵液粗酶活達(dá)298.8IU/mL。其最適反應(yīng)溫度為50。C,最適pH為9.0;保溫lh,酶活穩(wěn)定溫度≤45。C,穩(wěn)定pH為9.0-
3、10.0。酶催化作用依賴于ca2+,其最適作用濃度為2mmol/L;Zn2+、Ca和NH4+促進(jìn)酶活力,F(xiàn)e。和Pb嚴(yán)重抑制酶活力;聚半乳糖醛酸鈉為該酶的最適底物?!窘Y(jié)論】從麻類(lèi)脫膠高效菌株中發(fā)掘到堿性果膠裂解酶基因,其表達(dá)產(chǎn)物在生物質(zhì)加工過(guò)程中具有重要工業(yè)化應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞:麻類(lèi)脫膠,高效菌株,果膠裂解酶,基因克隆,酶學(xué)性質(zhì)基金項(xiàng)目:國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(No.2006AA02Z249);國(guó)家麻類(lèi)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(No.CARS一19一E24)通訊作者:Tel:86—731—88998535;Fax:86-731.88998528;
4、函:ibfclzc@189.cn收稿日期:2012—10.31:接受日期:2012.12.061404微生物學(xué)通報(bào)Microbio1.China2013,Vo1.40,No.8~J?51oninganc1Iexpressl●on0tnapect-ate一lyasegenef一romaneficientstrainforbastfiberbio-·extractingCHENGLi-FengLIUZheng.ChuDUANSheng—WenFENGXiang.YuanZHENGKeZHENGXiaCHENGYi(InstituteofBast
5、FiberCrops,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Changsha,Hunan410205,China)Abstract:【Objective1Weclonedandexpressedthepectatelyasegenee1)fromDickeyasp.DCE一01astrainforbastfiberbio—extracting,inE.coliBL21(DE3).Thenwecharacterizedthepurifiedpectatelyase(Pe1).【Methods】Primers
6、weredesignedbythepotentialpelQ59419annotatedfromthewholegenomesequenceofDickeyasp.DCE一01.ThepelwasclonedlinkedtopEASY-E1andpACYCDuet一1,andexpressedinE.coliBL21(DE3).Aftercompar—ingtheactivitiesofextracellularPelfromtheengineeringstrains,thePelwithhighestactivitywaspurified
7、bythetwo—stepprocessinvolvingultrafiltrationandgelfiltration(SephadexG一100)andthencharacterized.【ResultslThepel(GenBank:JX964997)was1128bpandencoded375aminoacids.ThehighestactivityoftheextracellularPelfrompACY—CDuet一1-pel—BLstrainwas298.8IU/mL.Theoptimalconditionforthepuri
8、fiedenzymewasat5O。C,pH9.0andpolygalacturonicacidsodiumasasubstrate.Thecatalyticactivityof