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1、第三節(jié)PCR技術(shù)原理PCR（polymerasechainreaction）是指模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的方式在體外選擇性的擴增DNA某個特殊區(qū)域的技術(shù).PCR是80年代發(fā)展起來的新技術(shù)，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、基因工程和其它與DNA鑒定相關(guān)領(lǐng)域，如疾病檢測、臨床應(yīng)用、商品檢疫、法醫(yī)鑒定、新藥品的開發(fā)等。返回第二章2.3.1核酸體外擴增最早的設(shè)想由Khorana及其同事于1971年提出：“經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重視該過程便可克隆tRNA基因”。但由于當(dāng)時很難進(jìn)行測序和合成寡核苷酸引物，且當(dāng)時(1970年)
2、Smith等發(fā)現(xiàn)了DNA限制性內(nèi)切酶，使體外克隆基因成為可能，所以，使Khorana等的早期設(shè)想被人們遺忘。2.3.2聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人才發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR),其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。開始是使用大腸桿菌DNA聚合酶。耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使PCR反應(yīng)更易于自動化。PE-Cetus公司推出的第一臺PCR熱循環(huán)儀，使該技術(shù)的自動化成為現(xiàn)實。PCR具有劃時代意義，Mullis等因此項技術(shù)于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎PCR傳奇《自
3、然》周刊1976年的《細(xì)菌學(xué)雜志》（JournalofBacteriology）：臺灣錢嘉韻（AliceChang）文獻(xiàn)耐熱DNA聚合酶《科學(xué)》周刊先后拒發(fā)表《酶學(xué)方法》（MethodsofEnzymology）：吳瑞1983年春天的一個周五晚上，Mullis開車帶著女友前往鄉(xiāng)間的小屋度周末。在蜿蜒的鄉(xiāng)間公路上開著車，一段DNA反復(fù)復(fù)制的景像，在他的腦海里冒了出來。PE-Cetus公司與MullisCetus70年代以制造維生素及抗生素為主開始轉(zhuǎn)型，進(jìn)入80年代以基因產(chǎn)品為主的研發(fā)：生長激素、胰島素、凝血因子、干擾素、白介素等2.3.3
4、PCR原理基本原理：即DNA合成的基本原理基本要素：teplate/primer/DNApolmeraseTemplate:ssDNAordsDNAPrimers:oligo-nucleotides等Substrates:dNTPDNApolymerase:Taqpolymerase5’amplicon3’3’5’94℃37℃72℃Cycle12分子Cycle24分子Cycle38分子2.3.4PCR反應(yīng)過程①變性:將模板DNA置于95℃的高溫下，使雙鏈DNA的雙鏈解開變成單鏈DNA；②退火:將反應(yīng)體系的溫度降低至55℃左右，使得一對引
5、物能分別與變性后的兩條模板鏈相配對；③延伸:將反應(yīng)體系溫度調(diào)整到TaqDNA（耐熱）聚合酶作用的最適溫度72℃，然后以目的基因為模板，合成新的DNA鏈。如此反復(fù)進(jìn)行約30個循環(huán)左右，即可擴增得到目的DNA序列。一般需使用一對引物新合成的鏈又可作為模板94℃4min94℃1min4℃+∞72℃10min72℃1min65℃1min變性退火延伸30循環(huán)2.3.5PCR反應(yīng)體系緩沖液buffer（1×）：50mMKCl引物退火10mMTris.HClpH8.3-9.01.5mMMgCl2(0.5-2.5)dNTP：終濃度0.2mM(即飽和濃度
6、)（pH7.0）4種dNTP應(yīng)平衡，提高忠實性使用時應(yīng)考慮Mg2+，引物，產(chǎn)量之間的關(guān)系如序列分析和制備探針時，用20-40mm引物：各1mm，即1pmol/mlOD260=1時:dsDNA50mg/ml（molecularcloning）ssDNA40mg/mloligo33mg/ml引物與退火溫度：長度至少16bp，通常20-30bpTm=81.5-16.6log[J+]+0.041(G+C)%-(600/N)N：鏈長J：單價離子濃度若N=20G+C%=55%[J+]=60mmol/L，則：Tm=81.5-20.3+22.6-30=
7、53.8簡單計算Tm=（G+C）×4+（A+T）×2（用于較短引物）還可從internet計算避免二級結(jié)構(gòu)的形成二聚體二級結(jié)構(gòu)G/C和A/T分布盡管均勻，一般G+C%45-55%OligodT/oligodC除外其它，如5’末端，限制酶位點的長度隨機引物10-12bp引物設(shè)計原則：模板50μlPCR反應(yīng)體系中模板DNA推薦使用量2.3.6PCR的相關(guān)技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄PCR(retrotranscriptionPCR,RTPCR)指的是以RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得與RNA互補的DNA鏈即cDNA，然后以cDNA鏈為模板進(jìn)行的PCR反應(yīng)。錨定PC
8、R(anchoredPCR)適合于擴增那些只知道一端序列的目的DNA。例如，對于一端序列已知、一端序列未知的DNA片段，可以通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶給未知序列的那一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分別用多聚dC和
