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1、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片斷★分子生物學(xué)研究中最強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一★ 其本質(zhì)是在體外模擬胞內(nèi)DNA分子復(fù)制的過程美國(guó)科學(xué)家 穆利斯(K.B.Mullis)發(fā)明了PCR技術(shù)1993年諾貝爾獎(jiǎng)一、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。能以極少量的DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的ＤＮＡ拷貝。廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測(cè)定等。二、DNA分子的結(jié)構(gòu)1、基本組成單位——脫氧核苷酸脫氧核苷酸脫氧核苷磷酸脫氧核糖含氮堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）脫
2、氧核苷酸結(jié)構(gòu)式35一個(gè)核苷酸上的磷酸基團(tuán)上的“－OH”和另一個(gè)核苷酸分子的第三位碳原子上的羥基之間失去一分子水，形成磷酸二脂鍵，即在相鄰的兩個(gè)脫氧核苷酸的3’和5’碳原子之間形成磷酸二脂鍵。數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸通過3’、5’、磷酸二脂鍵彼此連接起來形成脫氧核苷酸鏈。通常將DNA的羥基“－OH”末端稱為3’端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為5’端。2、多脫氧核苷酸鏈的形成OOPOHO堿基OOHOOPOHOOH堿基5’3’3’5’堿基脫氧核糖磷酸基團(tuán)堿基脫氧核糖堿基脫氧核糖5’3’多脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖3、DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)特
3、點(diǎn)①DNA分子是由兩條反向平行的（即一條鏈為3’－5’，另一條鏈為5’－3’）脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈盤旋而成的規(guī)則雙螺旋結(jié)構(gòu)。②脫氧核糖與磷酸交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；堿基排列在鏈的內(nèi)側(cè)。③兩條鏈上的堿基通過氫鍵連結(jié)起來，形成堿基對(duì)。堿基對(duì)的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與胸腺嘧啶配對(duì)，鳥嘌呤一定同胞嘧啶配對(duì)。三、DNA的復(fù)制2、時(shí)期有絲分裂間期或減數(shù)第一次分裂前的間期3、場(chǎng)所細(xì)胞核（主）（線粒體、葉綠體）4、模板DNA母鏈1、概念由一個(gè)DNA形成兩個(gè)完全相同的DNA的過程5、原材料脫氧核苷酸6、基本條件酶、ATP、原
4、料、模板7、復(fù)制過程①DNA的解旋親代DNA分子利用細(xì)胞提供的能量在解旋酶的作用下氫鍵斷裂，部分雙螺旋鏈解旋為兩條平行的雙鏈②RNA引物的合成以單股DNA為模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物。③DNA的生成以單股的DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5’端→3’端合成DNA。邊解旋邊復(fù)制(過程）8、復(fù)制特點(diǎn)半保留復(fù)制（結(jié)果）9、遵循原則堿基互補(bǔ)配對(duì)原則10、精確復(fù)制的原因11、復(fù)制的意義DNA分子通過復(fù)制使遺傳信息從親代傳給了后代，從而保持了遺傳信息的連續(xù)性。①規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)為復(fù)制提供了精
5、確的模板②堿基互補(bǔ)配對(duì)能力保證了復(fù)制準(zhǔn)確無誤的進(jìn)行參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物總結(jié)：胞內(nèi)DNA復(fù)制的基本體系打開DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸四、PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）1、PCR原理①在80－100℃的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個(gè)過程稱為變性。②當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會(huì)重新結(jié)合成雙鏈。③PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與
6、結(jié)合，現(xiàn)在使用的PCR儀實(shí)質(zhì)上也是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。變性復(fù)性延伸加熱到90℃，DNA雙鏈解旋為單鏈降到50℃，引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與單鏈DNA結(jié)合升溫到72℃，四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈2、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外DNA復(fù)制環(huán)境的區(qū)別體內(nèi)DNA的復(fù)制體外的模擬模板（母鏈）引物4種脫氧核苷酸DNA聚合酶反應(yīng)環(huán)境細(xì)胞內(nèi)源引物合成酶細(xì)胞內(nèi)源細(xì)胞內(nèi)源細(xì)胞內(nèi)環(huán)境外源加入外源加入外源加入外源加入緩沖液①PCR過程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA單鏈，其長(zhǎng)度通常為20－30個(gè)脫
7、氧核苷酸。3、細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和PCR的主要不同點(diǎn)②PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對(duì)反應(yīng)溫度的控制來實(shí)現(xiàn)的。4、DNA聚合酶特性不能從頭合成DNA，只能從DNA的3′端開始延伸DNA鏈，因此，DNA復(fù)制需要引物。5、DNA聚合酶作用過程當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。高溫解決了打開雙鏈的問題，但又導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的TaqDNA聚合酶解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活，促成了PCR技術(shù)的自動(dòng)化。
8、6、TaqDNA聚合酶的應(yīng)用7、緩沖液需要為PCR反應(yīng)提供的物質(zhì)DNA模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的DNA聚合酶存在于緩沖液中，同時(shí)通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等特性
