《基因工程PCR》PPT課件

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1、第四節(jié)DNA聚合酶鏈式反應(yīng)PCR技術(shù)是一種模擬DNA體內(nèi)復(fù)制過程的體外DNA復(fù)制過程，在一個離心管的緩沖液體系中，加入DNA模板，dNTPs,引物和DNA聚合酶，然后通過變性、退火、延伸三個溫度的不斷循環(huán)，使得目標DNA得到快速大量的復(fù)制。PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究和醫(yī)療事業(yè)，比如DNA的克隆，序列分析，醫(yī)學(xué)診斷以及生物系統(tǒng)發(fā)生科學(xué)的研究等。反應(yīng)需要兩條合成的寡核苷酸片段和耐熱的DNA聚合酶。一般用TaqDNA聚合酶，是從棲熱水生菌（Thermusaquaticus）中提取出來的。兩條引物分別和正義鏈和反義

2、鏈的3’端結(jié)合，然后朝著彼此的3’-OH方向延伸。PolymeraseChainReaction（PCR）PolymeraseChainReaction（PCR）947256反應(yīng)的第一步是加熱DNA到95oC進行變性（denature）使雙鏈解離為單鏈，解除變性條件后在較低的溫度50oC下引物退火（annealed）結(jié)合到目標序列上，然后在72oC下，在dNTPs存在的情況下，DNA聚合酶運用使引物序列延伸（extends）。熱穩(wěn)定的酶不僅可以使DNA快速合成,而且在較寬的溫度范圍內(nèi)都能催化DNA合成。三個步驟：

3、變性,退火和延伸PCR循環(huán):一般25-40個循環(huán).每個循環(huán)都使目標序列翻倍從而PCR可以快速擴增PolymeraseChainReaction（PCR）PCR擴增過程中片段增殖的計算隨著擴增循環(huán)數(shù)的增加，長鏈目標片段增加的值為2(n+1),而短鏈目標片段則以幾何倍數(shù)增加值為2(n+1)–2(n+1)。20個循環(huán)后,目標片段大約增加1百萬倍。PCR使用的引物需特異性與目標序列匹配，如果引物與DNA分子的其他部位結(jié)合,非特異擴增將產(chǎn)生。引物與目標序列的特異性結(jié)合取決于溫度,每對引物最適的溫度要通過實驗獲得。寡核苷酸引

4、物的長度一般為20-25個堿基，GC含量一般為50%左右，這樣退火溫度在52-58oC之間。很長的寡核苷酸引物或高的GC含量需要很高的溫度，而短的寡核苷酸引物或低的GC含量則需要較低的溫度。對于17-25個堿基的引物,Tm的計算為:最適的退火溫度一般比Tm低3-5oC。Primerdesignandcycleoptimization1、所設(shè)計引物長度范圍為18-27堿基，最長不超過38，因為過長會導(dǎo)致延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進行反應(yīng)。2、引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當沒有相似性較高，尤其是3'端相似性較

5、高的序列，否則會容易導(dǎo)致錯配。引物3'端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發(fā)率增加。引物退火溫度在50-70℃之間，上下引物之間退火溫度相差不超過5℃。3、GC含量在40-60%之間，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。4、3'末端最好不是A，3'末端為A的錯配效率明顯高于其它三個堿基。引物設(shè)計原則PCR反應(yīng)體系的確立WaterBuffer（10×）Mg++（25mM）dNTPs（10mM）Primer1（10uM）Primer2（10uM）Taq（5U/uL）Tem

6、plets12.821.60.4110.211282016410102…20uL反應(yīng)體系中各成分的母液濃度及加入量PCR擴增程序舉例Tem.94℃94℃56℃72℃72℃Time00:08:0000:00:3000:00:4000:01:0000:07:00Cycles――35――PCR反應(yīng)的應(yīng)用廣泛應(yīng)用于科研和實際檢測中，用于DNA研究、序列分析、基因表達測定、從cDNA庫放大特定克隆、構(gòu)建基因圖、進化分析、生物證據(jù)分析、醫(yī)學(xué)研究與臨床檢驗、性別控制、轉(zhuǎn)基因生物檢測等。PCR擴增結(jié)果分析舉例M1234567MM

7、,marker;1-2,PCRforCP4-EPSPSgene;3-4,PCRfor35SPromoter;5-6,PCRforlectingene;7,Negtivecontrol.思考題：名詞解釋：PCR簡述PCR反應(yīng)的基本原理和引物設(shè)計的原則是什么？