基因工程與pcr

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1、生物化學(xué)CAI課件A第13章基因工程與PCR作者高新旺祁新芝河南省周口衛(wèi)校目錄學(xué)習(xí)目標(biāo)PCR技術(shù)復(fù)習(xí)題重點(diǎn)內(nèi)容：基因工程基因工程學(xué)習(xí)目標(biāo)1.說(shuō)出基因工程的操作步驟2.列出基因工程的主要工具酶3.簡(jiǎn)述PCR技術(shù)的工作原理4.列出PCR的操作步驟學(xué)時(shí)分配第一節(jié)2學(xué)時(shí)第二節(jié)1學(xué)時(shí)第一節(jié)基因工程基因工程又稱重組DNA技術(shù)，是對(duì)攜帶遺傳信息的分子進(jìn)行設(shè)計(jì)和改造的分子工程，包括基因重組、克隆和表達(dá)?；蚬こ膛c蛋白質(zhì)工程、酶工程和細(xì)胞工程共同構(gòu)成了當(dāng)代新興的學(xué)科領(lǐng)域—生物技術(shù)工程。一、基因工程的相關(guān)概念（一）DNA克隆所謂克隆(clone)就是來(lái)自

2、同一始祖的相同拷貝(copy)的的集合；獲取同一拷貝的過(guò)程稱為克隆化，也就是無(wú)性繁殖。通過(guò)無(wú)性繁殖過(guò)程獲得的“克隆”，可以是分子的，也可以是細(xì)胞的，動(dòng)物的或植物的。在分子遺傳學(xué)領(lǐng)域所謂的分子克隆專指DNA的克隆。DNA克隆就是應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)—同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子—復(fù)制子(replicon)，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子，既DNA克隆。由于早期研究是從較的染色體

3、分離、擴(kuò)增特異性基因，因此DNA克隆又稱基因克隆(genecloning)?？寺∧骋换蚧駾NA片段過(guò)程中，將外源DNA插入載體分子所形成的復(fù)制子是雜合分子—嵌合DNA，所以DNA克隆或基因克隆又稱重組DNA。實(shí)現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關(guān)的工作統(tǒng)稱重組DNA技術(shù)，又稱基因工程。（二）工具酶在重組DNA技術(shù)中，常需要一些工具酶進(jìn)行基因操作。1·限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶能識(shí)別特異的DNA序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA分子。限制性核酸內(nèi)切酶存在于細(xì)菌體內(nèi)，種類很多。目前發(fā)現(xiàn)的限制性核酸內(nèi)切酶有1800種以上，常用的有幾十

4、種?，F(xiàn)列舉某些限制性核酸內(nèi)切酶如下頁(yè)表（其命名是根據(jù)含有該酶的微生物種屬而定，如從淀粉液化芽孢桿菌H株分離出的第一種限制酶命名為BamHⅠ）。下表：限制性核酸內(nèi)切酶5'…GGATCC…3'5'…AGATCT…3'5'…GAATTC…3'5'…AAGCTT…3'5'…GCGG…3'5'…GATC…3'5'…GATATG…3'名稱識(shí)別序列及切割位點(diǎn)切割后產(chǎn)生5突出末端：BamHⅠBglⅡEcoRⅠHindⅢHpaⅡMboⅠNdeⅠ續(xù)表：限制性核酸內(nèi)切酶名稱識(shí)別序列及切割位點(diǎn)切割后產(chǎn)生3突出末端：ApaⅠHaeⅡKpnⅠPstⅠSphⅠ切割

5、后產(chǎn)生平末端：AluⅠEcorⅤHaeⅢPvuⅡSmaⅠ5'…GGGCCC…3'5'…PuGCGCPy…3'5'…GGTACC…3'5'…CTGCAG…3'5'…GCATGC…3‘5'…AGCT…3'5'…GATATC…3'5'…GGCC…3'5'…CAGCTG…3'5'…CCCGGG…3'2·DNA連接酶DNA連接酶催化DNA分子中相鄰的5‘磷酸基和3’羥基末段之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片連接。3·DNA聚合酶Ⅰ其作用是：①合成雙鏈cDNA分子或片段連接②缺口平移制作高比活探針③DNA序列分析④填補(bǔ)3′

6、末端4·Klenow片段又名DNA聚合酶Ⅰ大片段，具有完整的DNA聚合酶Ⅰ的5'→3'聚合、3'→5'外切活性，。常用cDNA于的合成，雙鏈DNA3'末端標(biāo)記等5·反轉(zhuǎn)錄酶其作用是：①合成cDNA②替代DNA聚合酶Ⅰ進(jìn)行填補(bǔ)、標(biāo)記或DNA序列分析6·多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羥基末端磷酸化或標(biāo)記探針7·末端轉(zhuǎn)移酶在3‘羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾8·堿性磷酸酶切除末端磷酸基（三）目的基因應(yīng)用重組DNA技術(shù)的目的是為獲得某一感興趣的基因或DNA序列，或是為獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物—蛋白質(zhì)。這些感興趣的基因或DNA序列就是目的基因，又稱

7、目的DNA。目的基因有兩種類型，即cDNA和基因組DNA。cDNA是指經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的與RNA（通常指mRNA或病毒RNA）互補(bǔ)的單鏈DNA。以單鏈cDNA為模板經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙鏈cDNA?；蚪MDNA是指代表一個(gè)細(xì)胞或生物體整套遺傳信息（然色體及線粒體）的所有DNA序列。目的基因又稱外源DNA。（四）基因載體基因載體或稱克隆載體，是為攜帶感興趣的目的基因、實(shí)現(xiàn)目的基因的無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子?？沙洚?dāng)基因載體的DNA分子有質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA和病毒DNA。它們經(jīng)適當(dāng)改造后仍具有自我復(fù)制能力，或兼有表達(dá)外

8、源基因的能力。所謂質(zhì)粒是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子,小的2~3kb，大的可達(dá)數(shù)百kb。質(zhì)粒分子本身是含有復(fù)制功能的遺傳結(jié)構(gòu)，能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主的進(jìn)行復(fù)制，并在細(xì)胞分裂時(shí)保持恒定地傳給子代細(xì)胞。質(zhì)粒帶有