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《HPLC高效液相色譜法培訓(xùn)課件.ppt》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、高效液相色譜法HighPerformanceLiquidChromatographyHPLC1講授提綱HPLC儀器HPLC基本操作HPLC使用注意事項HPLC分類分析中的實際問題2Agilent1100儀器31HPLC的組成及工作流程1螺旋注射泵2往復(fù)柱塞泵3往復(fù)隔膜泵4氣動放大泵1自動進(jìn)樣器2手動進(jìn)樣器1液固2液液3鍵合相色譜4離子交換5空間排阻1紫外檢測器2熒光檢測器3蒸發(fā)光散射4示差折光檢測器5電化學(xué)檢測器6電導(dǎo)檢測器7質(zhì)譜檢測器色譜柱是高效液相色譜儀的“心臟”，是實現(xiàn)色譜分離的基礎(chǔ)。4儀器組成高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)色譜分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)5儀器組成高壓輸液系
2、統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)6高壓輸液系統(tǒng)溶劑貯液瓶溶劑脫氣裝置高壓輸液泵梯度洗脫裝置7溶劑貯液瓶用途：貯存流動相溶劑材料：玻璃或塑料，無色或棕色，容積：約為0.5～2.0L位置：高于泵，以保一定的輸液靜壓差。8溶劑脫氣裝置真空脫氣機在線真空脫氣機可實現(xiàn)流動相在進(jìn)入輸液泵前的連續(xù)真空脫氣，適用于多元溶劑系統(tǒng)。簡單的高效液相色譜儀無在線脫氣裝置，流動相必須用離線脫氣法。9真空脫氣機10溶劑脫氣方法離線脫氣法抽真空脫氣超聲波振蕩脫氣吹氦脫氣在線脫氣法11抽真空脫氣——常用方法用微型真空泵，降壓至0.05~0.07MPa即可除去溶解的氣體。使用真空泵連接抽濾瓶可以一起
3、完成過濾和脫氣的雙重任務(wù)。濾膜常用0.45μm，分有機相和水相膜，切不可用水相膜過濾有機相。12將流動相置于超聲波清洗機中，用超聲波振蕩10~30min，即可。用在液體中比空氣中溶解度低的氦氣，以60mL／min的流速緩緩地通過流動相10~15min，除去溶于流動相中氣體。超聲波振蕩脫氣吹氦脫氣13高壓輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。輸液泵的性能好壞直接影響到整個系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性。14輸液泵應(yīng)具備的性能①流量穩(wěn)定，其RSD應(yīng)＜0.5%。對定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。②流量范圍寬，分析型應(yīng)在0.1~10ml/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型能達(dá)到100ml/m
4、in。③輸出壓力高，一般可高達(dá)400~500kg/cm2。④液缸容積小，適于梯度洗脫。⑤密封性好，耐腐蝕。15輸液泵類型1螺旋注射泵2往復(fù)柱塞泵3往復(fù)隔膜泵4氣動放大泵目前應(yīng)用最多的是柱塞往復(fù)泵。16泵的使用與維護(hù)防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，因此應(yīng)過濾流動相。流動相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動相不應(yīng)停泵過夜或保留在泵內(nèi)更長時間。必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于保存色譜柱和有利于泵維護(hù)的溶劑。17泵的使用與維護(hù)防止流動相耗盡空泵運轉(zhuǎn)，導(dǎo)致柱塞磨損、缸體或密封損環(huán)，最終產(chǎn)生漏液。輸液泵的工作壓力不能超過規(guī)定的最高壓力，否則會使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液(40M
5、Pa,400bar,5800psi)。流動相應(yīng)脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。18梯度洗脫裝置用途：梯度洗脫。等度(isocratic)高效液相洗脫方式梯度(gradient)低壓梯度（外梯度）梯度洗脫方式高壓梯度（內(nèi)梯度）19低壓梯度在常壓下將兩種或多種溶劑按一定比例輸入泵前的比例閥中混合后，再用高壓泵將流動相以一定的流量輸出至色譜柱。常見的是四元泵，如waters2690/2695；Agilent1100。特點：只需一個高壓輸液泵，由計算機控制四元比例閥來改變?nèi)軇┍壤?，實現(xiàn)二元~四元梯度洗脫，成本低廉、使用方便。由于溶劑在
6、常壓下混合，易產(chǎn)生氣泡，需要良好的在線脫氣裝置。20梯度洗脫系統(tǒng)（低壓梯度）21高壓梯度一般只用于二元梯度，即用兩個高壓泵分別按設(shè)定比例輸送兩種不同溶液至混合器，在高壓狀態(tài)下將兩種溶液進(jìn)行混合，然后以一定的流量輸出。主要優(yōu)點：只要通過梯度程序控制器控制每個泵的輸出，就能獲得任意形式的梯度曲線，且精度很高，易實現(xiàn)自動化控制。如：waters51522梯度洗脫系統(tǒng)（高壓梯度）23進(jìn)樣系統(tǒng)作用：將試樣引入色譜柱位置：在高壓泵和色譜柱之間類型：手動或自動進(jìn)樣器：六通閥24進(jìn)樣器手動六通閥經(jīng)注射器進(jìn)樣自動六通閥圓盤式自動進(jìn)樣器鏈?zhǔn)阶詣舆M(jìn)樣器2526六通閥手動進(jìn)樣器原理示意圖Load
7、Inject27六通閥有6個接口，1和4之間接定量環(huán)，2接高壓泵，3接色譜柱，5、6接廢液管。定量環(huán)常見體積有5、10、20、50μL等，可以根據(jù)需要更換不同體積的定量環(huán)。28手動進(jìn)樣器用微量注射器將樣品溶液注入六通閥注意必須使用HPLC專用平頭微量注射器，不能使用氣相色譜尖頭微量注射器，否則會損壞六通閥。進(jìn)樣方式：有部分裝液法和完全裝液法29進(jìn)樣方式①部分裝液法：注入的樣品體積應(yīng)不大于定量環(huán)體積的50%，并要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同。②完全裝液法：注入的樣品體積應(yīng)最少是定量環(huán)體積的3倍，以完全置換定量環(huán)內(nèi)流動相，消除管壁效應(yīng)
