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《行業(yè)標準：BJS 201907 鱈魚及其制品中裸蓋魚、油魚和南極犬牙魚源性成分檢測.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、鱈魚及其制品中裸蓋魚、油魚和南極犬牙魚源性成分檢測BJS2019071范圍本方法規(guī)定了鱈魚及其制品中裸蓋魚（Anoplopomafimbria）、油魚（Lepidocybiumflavobrunneum，Ruvettuspretiosus）和南極犬牙魚（Dissostichuseleginoides，Dissostichusmawsoni）源性成分的實時熒光PCR檢測方法。本方法適用于鱈魚、鱈魚片、鱈魚扒等生鮮或速凍鱈魚產品（不包含魚丸、魚糕、魚餅、魚腸、魚豆腐、魚肝油等加工產品）中裸蓋魚、油魚和南極犬牙魚源性成分的
2、定性檢測。2原理使用商業(yè)化DNA提取試劑盒，獲得適用于實時熒光PCR檢測的DNA。分別使用裸蓋魚、油魚或南極犬牙魚特異性引物探針，通過實時熒光PCR反應，獲得Ct值，根據Ct值判斷樣品是否檢出裸蓋魚、油魚或南極犬牙魚源性成分。3試劑和材料除另有規(guī)定外，本方法中所用試劑均為分析純，水應符合GB/T6682的一級水要求。所有試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。3.1引物探針序列3.1.1裸蓋魚源性成分NADH2基因裸蓋魚源成分5’端引物：5’-AGGGACCACCCTAACATTCG-3’裸蓋魚源性成分3’端引物：5’-G
3、TGGGTGGTGATGCTGTGCT-3’裸蓋魚源性成分探針：5’-FAM-CAGCTCTCACTGACTACTCGCATGA-BHQ1-3’3.1.2油魚源性成分Cytb基因油魚源性成分5’端引物：5’-TAACTTCGGATGACTCATCCG-3’油魚源性成分3’端引物：5’-AGTAAAGGCCTCGTCCAATGT-3’油魚源性成分探針：5’-FAM-CATCCGAAACCTTCATGCAAACGGC-BHQ1-3’3.1.3南極犬牙魚源性成分CK基因南極犬牙魚源性成分5’端引物：5’-CTGAATATG
4、TAGGTGCATACG-3’南極犬牙魚源性成分3’端引物：5’-TTGCTCTTTGTGTTTCGGTT-3’南極犬牙魚源性成分探針：5’-FAM-TCCATTAGGTAAGCGAGCGGGAAGA-BHQ1-3’3.1.4內參照基因真核生物18SrRNA—1——內參照5’端引物：5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’內參照3’端引物：5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’內參照探針：5’-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC-BH
5、Q1-3’3.2商業(yè)化DNA提取試劑盒。3.3商業(yè)化PCR反應預混液。4儀器和設備4.1實時熒光PCR儀。4.2微量紫外分光光度計。4.3恒溫水浴鍋。4.4高速冷凍離心機：離心力18,000g以上。4.5微量移液器（0.5μL-10μL，10μL-100μL，20μL-200μL，100μL-1000μL）。4.6渦旋振蕩器。4.7天平：感量0.001g。5分析步驟5.1樣品前處理（1）樣品只有單塊魚肉組成：使用滅菌剪刀適量剪取中心部位魚肉。（2）樣品有五塊以下魚肉組成：使用滅菌剪刀適量剪取每個組成部分的中心部位魚肉
6、。（3）樣品有五塊以上魚肉組成：隨機挑選5塊魚肉，使用滅菌剪刀適量剪取每個組成部分的中心部位魚肉。將所取得的魚肉使用滅菌去離子水洗滌，離心去除上清液，盡可能剪碎并混勻。注：速凍鱈魚產品應在完全解凍后再取樣。5.2DNA提取按照商業(yè)化DNA提取試劑盒說明書中要求的取樣量稱取樣品，每個樣品設置兩個平行，按照商業(yè)化DNA提取試劑盒說明書操作。5.3DNA濃度測定取1μLDNA溶液，使用微量紫外分光光度計按照dsDNA（雙鏈DNA）計算方式檢測其濃度。5.4實時熒光PCR擴增實時熒光PCR反應體系見表1。表1實時熒光PCR反
7、應體系PCR預混液（2×）10μL10μmol/L上游引物0.4μL—2——10μmol/L下游引物0.4μL10μmol/L探針0.2μLDNA20-50ng滅菌去離子水補充至總體積20μLPCR反應程序：95℃15s；95℃5s，60℃34s（讀取熒光），40個循環(huán)。5.5實驗對照分別設置陽性對照、陰性對照、PCR空白對照、空白提取對照各一個。陽性對照：含相應物種的DNA。陰性對照：不含相應物種的DNA。PCR空白對照：以滅菌去離子水替代DNA加入實時熒光PCR反應體系?？瞻滋崛φ眨阂詼缇ルx子水替代樣品進行D
8、NA提取。6結果判斷與表述6.1質量控制若以下條件的其中一條不滿足要求時，結果視為無效：陽性對照：熒光通道出現典型的擴增曲線，相應的Ct值＜30.0；陰性對照：Ct值≥35.0；PCR空白對照：Ct值≥35.0；空白提取對照：Ct值≥35.0；內參照反應：熒光通道出現典型的擴增曲線，相應的Ct值＜30.0；樣品平行反應：Ct值經6.2結果判定后
