小鼠脾臟、胸腺單個核細(xì)胞分離課件.ppt

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1、小鼠脾臟、胸腺單個核細(xì)胞分離1基本概念所有參與免疫應(yīng)答以及與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞均被稱為免疫細(xì)胞。包括淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、DC、各種粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、肥大細(xì)胞、干細(xì)胞。23免疫細(xì)胞分離方法：根據(jù)不同免疫細(xì)胞表面標(biāo)志:FACS、MACS根據(jù)細(xì)胞理化性質(zhì)：1）根據(jù)細(xì)胞比重差異：自然沉降法、密度梯度離心法、改變細(xì)胞密度法2）根據(jù)細(xì)胞黏附特性：B細(xì)胞黏附于尼龍棉3）根據(jù)細(xì)胞對滲透壓變化的敏感度：紅細(xì)胞對低滲敏感4T細(xì)胞表面標(biāo)志及其亞群CD3+CD4+CD8-輔助性T細(xì)胞（helpTcell,Th）CD3+CD4-CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxicTcell,Tco

2、rCTL）CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatoryTcell,TrorTreg）5B細(xì)胞表面標(biāo)志SmIg、Fc受體、補體受體、EB病毒受體，部分CD分子是B細(xì)胞的重要表面標(biāo)志，其中以SmIg為B細(xì)胞所特有，是鑒定B細(xì)胞可靠的指標(biāo)。CD19/CD5分子：可將B細(xì)胞區(qū)分為B1細(xì)胞和B2細(xì)胞，B1細(xì)胞為CD19和CD5雙陽性，而B2細(xì)胞僅為CD19陽性，B2細(xì)胞為通常所指的B細(xì)胞。6NK細(xì)胞表面標(biāo)志人類NK細(xì)胞表面標(biāo)志主要以CD16、CD56來認(rèn)定，臨床上將CD3-CD56+CD16+淋巴細(xì)胞認(rèn)定為NK細(xì)胞。7流式細(xì)胞儀由激光光源系統(tǒng)，氣控單細(xì)胞層流系統(tǒng)，光檢

3、測及信息處理系統(tǒng)和細(xì)胞分離純化系統(tǒng)組成。流式細(xì)胞術(shù)(FCM)是一種對處在液流中的單個細(xì)胞或其它生物微粒（如細(xì)菌）等進行快速定量分析和分選的技術(shù)，它將免疫熒光與細(xì)胞生物學(xué)、流體力學(xué)、光學(xué)和電子計算機等多種學(xué)科的高新技術(shù)融為一體，進行細(xì)胞和分子水平的基礎(chǔ)理論與臨床應(yīng)用研究。將熒光標(biāo)記的單克隆抗體加入PBMC懸液內(nèi)，使二者特異性結(jié)合，通過流式細(xì)胞儀自動檢測，既可很快得到T、B細(xì)胞及其亞群百分率和絕對值的有關(guān)數(shù)據(jù)，又能以每秒高達5000個細(xì)胞(18×106細(xì)胞/h)的速度分離和收集無菌的淋巴細(xì)胞，純度可達90%～99%，細(xì)胞活性亦不受影響，可用于淋巴細(xì)胞的各種免疫生物學(xué)功能

4、測定。FACS8熒光激活細(xì)胞分離儀分離法9流式細(xì)胞分析儀10磁性微珠是20世紀(jì)80年代初以高分子材料和金屬離子（如Fe3O4）為原料聚合而成的一種以金屬離子為核心、外層均勻地包裹高分子聚合體的固相微粒。以磁性微珠為載體，包被上針對某種細(xì)胞表面抗原的特異性抗體即可制成免疫磁性微珠。MACS通常有二種分離方式：陽性分離和陰性分離?；驹砑安襟E：首先將抗特異細(xì)胞表面抗原的抗體致敏到磁珠上，待它與混合體系中的細(xì)胞反應(yīng)后，利用磁力的作用，使與致敏結(jié)合的細(xì)胞與其它物質(zhì)分離，達到純化、分離的目的。111213免疫磁珠法細(xì)胞分選過程14免疫磁珠細(xì)胞分選裝置15全自動細(xì)胞分選系統(tǒng)1

5、6Ficoll-Hypaque密度梯度離心法：人外周血單個核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcellPBMC)包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其體積、形狀和比重與其他細(xì)胞不同，利用密度在1.077±0.001g/L之間近于等滲的Ficoll-Hypaque混合溶液(稱為淋巴細(xì)胞分層液)作密度梯度離心時,各種血液成分將按密度梯度重新分布聚集。密度梯度離心法17不同細(xì)胞密度不同人的紅細(xì)胞密度為1.093粒細(xì)胞密度為1.092單個核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）的密度為1.075-1.09018不同細(xì)胞密度不同19用1.077±0.001的分層液可將細(xì)胞分離

6、20密度梯度離心法離心后血漿單個核細(xì)胞（PBMC）粒細(xì)胞紅細(xì)胞21實驗五小鼠脾臟、胸腺單個核細(xì)胞分離22胸腺位于胸腔胸骨后、縱隔前上方，覆蓋在心臟前上方的白色組織。通常小鼠鼠齡越小，胸腺體積相對越大。小鼠脾臟位于上腹部左后側(cè)，體積較大，長條形態(tài)，屬于外周免疫器官。外周血中淋巴細(xì)胞可經(jīng)再循環(huán)駐入脾臟等外周免疫器官的特定區(qū)域，所以富含各類免疫細(xì)胞。解剖圖23取脾臟實驗步驟：（一）取小鼠脾臟：小鼠頸椎脫位處死，置70%乙醇溶液中浸泡3~5min；取其后右側(cè)臥位，消毒左側(cè)背腹交界處皮膚，取脾臟并盡量將去脂肪及筋膜組織。24（二）制備單個核細(xì)胞懸液：將取出的脾臟置于盛有PB

7、S緩沖液的平皿中，然后再置于尼龍指套中。用針芯輕輕碾磨使單個核細(xì)胞通過尼龍指套懸浮于平皿中；吸取平皿中細(xì)胞懸液置于刻度離心管中，以1500rpm離心10min。棄去上清，加ACK至2~3ml，輕輕吹打混勻并放置3~4min，以破壞紅細(xì)胞。然后加PBS緩沖液至10ml，以1500rpm離心10min；棄去上清，加PBS緩沖液至10ml，以1500rpm離心10min；棄去上清，加PBS緩沖液至10ml，吹打混勻即為小鼠脾臟單個核細(xì)胞懸液。實驗步驟：25（三）計算細(xì)胞濃度將上述細(xì)胞懸液做一定倍數(shù)的稀釋；混勻稀釋后，取1滴加至細(xì)胞計數(shù)板中，計數(shù)細(xì)胞計數(shù)板中4大方格細(xì)胞