《單個(gè)核細(xì)胞分離》PPT課件

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1、2007級(jí)五年制本科生免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課楊巍第四次實(shí)驗(yàn)課人外周血單個(gè)核細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)內(nèi)容人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離（實(shí)驗(yàn)）淋巴細(xì)胞分離與檢測(cè)技術(shù)（講解）實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諉蝹€(gè)核細(xì)胞分離及淋轉(zhuǎn)的原理及方法熟悉淋巴細(xì)胞的檢測(cè)技術(shù)細(xì)胞分離純化的目的測(cè)定細(xì)胞免疫功能首先要從人或動(dòng)物外周血或組織中獲取有活性的細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞等。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，采用不同方法，主要需考慮(1)細(xì)胞純度；(2)細(xì)胞獲得量；(3)細(xì)胞活力；Ficoll密度梯度離心法常用來(lái)分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的分層液比重是1.077左右的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡

2、胺(Urografin）分層液。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大(1.092)，離心后沉于管底；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于或等于分層液比重(1.070)，離心后漂浮于分層液的液面上，吸取分層液液面的細(xì)胞，就可從外周血中分離到單個(gè)核細(xì)胞。比重：1.070比重：1.077比重：1.092FicollFicoll密度梯度離心法實(shí)驗(yàn)材料分組：兩人一組器材數(shù)量試劑數(shù)量滴管2支/2人分層液0.5ml/2人EP管1個(gè)/2人血液1ml/2人計(jì)數(shù)板1塊/2人PBS1瓶/4人1ml刻度吸管1支/4人計(jì)數(shù)液1管/4人加樣器(tip)1把/4人顯微鏡1臺(tái)/2人實(shí)驗(yàn)步驟1

3、.加樣：吸取1ml稀釋的血液沿試管壁緩慢加至分層液頂部(距1cm處)NOTE：不要打破血液與分層液的界面；2.分離：2,000r/min離心17min，離心后管內(nèi)液體可分為四層;3.回收：將吸管直接插入灰白層，沿管壁輕輕吸出灰白層單個(gè)核細(xì)胞，放入EP管中(NOTE：盡量少吸分層液);加入PBS至1ml，洗滌1次，4,000rpm/min，離心5分鐘，棄上清；4.計(jì)數(shù)：用500ulPBS重懸細(xì)胞，取10ul加到計(jì)數(shù)板內(nèi)，計(jì)數(shù)。（NOTE：如細(xì)胞數(shù)較多，用白細(xì)胞計(jì)數(shù)液做適當(dāng)稀釋?zhuān)儆?jì)數(shù)）5.調(diào)細(xì)胞濃度：細(xì)胞終濃度為：1×106/ml。（NO

4、TE：一般每ml健康成人血可分離1~2×106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，其中90%以上為淋巴細(xì)胞，部分是單核細(xì)胞）示意圖細(xì)胞計(jì)數(shù)方法查出四個(gè)大方格的總細(xì)胞數(shù)(X)算出每個(gè)大方格的細(xì)胞數(shù)：Y=X/4每個(gè)大方格的體積為V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml制備的細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度（/ml)=Y×104×稀釋倍數(shù)(50)4淋巴細(xì)胞分離及檢測(cè)技術(shù)巨噬細(xì)胞淋巴細(xì)胞DC細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離——免疫細(xì)胞的分離原理及方法免疫細(xì)胞：直接參與免疫應(yīng)答及與免疫應(yīng)答相關(guān)的所有細(xì)胞的總稱(chēng)。直接參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞主要為：T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞一.外周血單個(gè)

5、核細(xì)胞（PMBC）分離二.淋巴細(xì)胞亞群的分離及鑒定（表面標(biāo)志選擇性純化淋巴細(xì)胞亞群）E花環(huán)分離法尼龍纖維分離法免疫熒光法流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)磁珠分離術(shù)免疫細(xì)胞的分離1.細(xì)胞膜脆性：低滲液分離2.細(xì)胞密度：密度梯度離心法3.細(xì)胞表面標(biāo)志：流式細(xì)胞術(shù)，磁珠分離術(shù)4.細(xì)胞黏附性：黏附玻璃，塑料，尼龍毛免疫細(xì)胞分離的依據(jù)（一）外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的分離血中的細(xì)胞單個(gè)核——PBMC無(wú)核——紅細(xì)胞多核——多核白細(xì)胞PBMC的比重——1.075紅細(xì)胞多核白細(xì)胞平均比重——1.092Ficoll淋巴細(xì)胞分層液比重——

6、1.077密度梯度離心法分離原理離心前示意圖稀釋的抗凝血Ficoll分離液血漿PBMC（白膜狀）1.075Ficoll分離液1.077紅細(xì)胞、多核白細(xì)胞1.092離心后示意圖（二）T、B淋巴細(xì)胞的分離1、單核細(xì)胞的去除：（1）黏附去除法*原理：?jiǎn)魏思?xì)胞可黏附在塑料或玻璃表面而淋巴細(xì)胞不能。（2）L—亮氨酸甲酯去除法（3）羰基鐵吞噬離心法2、T、B淋巴細(xì)胞的分離純化（1）尼龍毛柱法**原理：B細(xì)胞易黏附在尼龍纖維上，洗脫的為非黏附性的T細(xì)胞。（2）E花環(huán)分離法*原理：人成熟T細(xì)胞表面的CD2分子為綿羊紅細(xì)胞受體（E受體），可結(jié)合綿羊紅細(xì)胞

7、形成E花環(huán)，比重增大，沉于管底。（3）其它：免疫熒光法、流式細(xì)胞術(shù)、磁珠分離法E花環(huán)分離法人成熟T細(xì)胞表面的CD2分子是綿羊紅細(xì)胞受體（E受體），能結(jié)合綿羊紅細(xì)胞形成E花環(huán)，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離后，因E花環(huán)形成細(xì)胞比重大而沉降于管底，再以低滲法裂解T細(xì)胞周?chē)木d羊紅細(xì)胞，即獲得了純化的T細(xì)胞。（三）小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離原理及方法：利用巨噬細(xì)胞可黏附在玻璃或塑料上的原理，吸取小鼠腹腔液體，離心洗滌，用培養(yǎng)液懸浮，沖洗三次，去除非黏附細(xì)胞，用橡皮棒輕輕刮取、解離貼壁細(xì)胞，即為巨噬細(xì)胞。免疫細(xì)胞的功能檢測(cè)——功能檢測(cè)的原理及方法免疫細(xì)胞功能

8、檢測(cè)的意義免疫系統(tǒng)或其他系統(tǒng)的疾病，免疫接種，某些臨床措施或外界環(huán)境的影響，均可使免疫細(xì)胞的數(shù)量和功能發(fā)生變化。因此，免疫細(xì)胞數(shù)量，功能檢測(cè)，對(duì)于疾病的診斷、發(fā)病機(jī)制研究、免疫治療、預(yù)防接種的效果評(píng)估及環(huán)境