外周血單個(gè)核細(xì)胞分離復(fù)習(xí)課程.ppt

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1、外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離及活力測(cè)定IsolationandstorageofPBMCandviabilitytest實(shí)驗(yàn)原理人外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。單個(gè)核細(xì)胞的體積、形態(tài)和比重與外周血其他細(xì)胞不同。因此利用一種介于1.075-1.090之間的聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque）分離液作密度梯度離心，離心后不同比重的血細(xì)胞在分離液中呈梯度分布,從而分離出PBMC。人血液中各種細(xì)胞的密度如下：紅細(xì)胞：1.0

2、93白細(xì)胞：1.092淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞：1.075-1.090血小板：1.030-1.035F/H=1.077±0.001肝素抗凝全血+等量Hanks液將F/H管稍傾斜將稀釋血液在距分層液界面上1cm處沿試管壁緩慢加至分層液上面。應(yīng)注意保持兩界面清晰，勿使血液混入分層液內(nèi)。Ficoll/Hypaque(2:1)1500rpm,20min水平離心血小板⒈簡(jiǎn)述補(bǔ)體的概念、分泌細(xì)胞及激活途徑。⒉簡(jiǎn)述補(bǔ)體的經(jīng)典激活途徑的具體過程。⒊補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)為什么需分兩階段進(jìn)行？如果將幾種成分反應(yīng)順序顛倒，結(jié)果會(huì)如何？⒋參

3、加補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)的各已知成分，為什么須預(yù)先滴定？試驗(yàn)中所設(shè)計(jì)的四種對(duì)照管有何意義？用毛細(xì)吸管輕輕插入灰白色層，沿管壁輕輕吸出該層的單個(gè)核細(xì)胞，盛入另一支離心管中。將所得到的PBMC懸液用5倍體積的Hanks液或RPMI-l640洗滌2次，1500rpm5min。淋巴細(xì)胞濃度（細(xì)胞數(shù)/ml）=四個(gè)大方格內(nèi)細(xì)胞數(shù)/4×104細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞至所需濃度臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞存活率臺(tái)盼藍(lán)（trypanblue）染色法是測(cè)定細(xì)胞活力的最簡(jiǎn)便的方法。臺(tái)盼藍(lán)又稱錐藍(lán)，是一種陰離子型染料，它不能透過活細(xì)胞正常完整

4、的細(xì)胞膜，故活細(xì)胞不著色，但死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加，可使染料通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使死細(xì)胞著色呈藍(lán)色。細(xì)胞存活率(%)＝無色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，一般活性應(yīng)在95％以上注意事項(xiàng)1.與血液樣品接觸時(shí)應(yīng)注意安全防護(hù)，避免血源性傳染病傳染。2.操作應(yīng)輕柔，細(xì)胞懸液應(yīng)充分混勻，避免損傷細(xì)胞活性及細(xì)胞丟失。3.細(xì)胞分層液在室溫下比重為l.077±0.001g/L；應(yīng)避光4℃下保存，取出后逐漸升至室溫后混勻，方可使用。使用中應(yīng)避免細(xì)菌污染。4.稀釋血液可降低紅細(xì)胞的凝集，提高淋巴細(xì)胞收獲量

5、，但如果要保留血漿成分作其他實(shí)驗(yàn)用時(shí)，則不能稀釋血液，以免影響血漿成分。E玫瑰花環(huán)試驗(yàn)Erythrocyterosetteformationtest原理T淋巴細(xì)胞表面有綿羊紅細(xì)胞受體（CD2），不需要任何處理可與綿羊紅細(xì)胞結(jié)合形成花環(huán)，B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞無綿羊紅細(xì)胞受體，因此形成E花環(huán)的細(xì)胞主要是T淋巴細(xì)胞。計(jì)算外周血中E花環(huán)形成細(xì)胞的百分率，可從數(shù)量大致推測(cè)機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)。原理TcellsSRBCE-rosetteE玫瑰花環(huán)試驗(yàn)高倍鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)以上的淋巴細(xì)胞中花環(huán)形成細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。凡能結(jié)合

6、三個(gè)以上SRBC者為花環(huán)形成細(xì)胞。正常值：60-80%淋巴細(xì)胞功能檢測(cè)—淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)Detectionoflymphocytefunction：lymphocytetransformationtest原理指體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞與特異性抗原或非特異性促有絲分裂物質(zhì)如植物血凝素（PHA）等接觸后發(fā)生胚變（或返祖）現(xiàn)象，轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞的一種方法。淋巴細(xì)胞在抗原或促有絲分裂原的刺激下淋巴細(xì)胞的DNA合成而分裂增殖，并在細(xì)胞形態(tài)上也向母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，因此通過形態(tài)學(xué)觀察或同位素?fù)饺敕蓽y(cè)得細(xì)胞分裂增殖的程度，從而判

7、斷淋巴細(xì)胞對(duì)有關(guān)刺激物的反應(yīng)及其功能，以此了解機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)。轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞意義由轉(zhuǎn)化率的高低可以了解人體免疫功能狀況。正常人淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率為50－70%，故此試驗(yàn)可作為某此疾病診斷和治療的參考。