實(shí)驗(yàn)1外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離.ppt

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1、實(shí)驗(yàn)1外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離——Ficoll密度梯度離心法實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆胀庵苎獑蝹€(gè)核細(xì)胞分離的原理和實(shí)際操作方法掌握離心機(jī)及顯微鏡等儀器的使用實(shí)驗(yàn)原理外周血各種血細(xì)胞的密度不盡相同，利用淋巴細(xì)胞分層液（Ficoll）作密度梯度離心，使一定比重的細(xì)胞群按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。實(shí)驗(yàn)原理外周血紅細(xì)胞粒細(xì)胞單個(gè)核細(xì)胞血小板淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞1.0931.030~1.0351.075~1.090Ficoll：1.077±0.001(PBMC)1.0921500rpm,20℃,30minPBMC紅細(xì)胞粒細(xì)胞Ficoll稀釋外周血Ficoll

2、稀釋的血漿、血小板材料與器材肝素抗凝的外周血淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll）：低溫避光保存稀釋液：Hanks液倒置顯微鏡、離心機(jī)華氏管、吸管、吸球、微量移液器、血球計(jì)數(shù)板及蓋玻片實(shí)驗(yàn)步驟1.采血，稀釋?zhuān)ㄍ庵苎合♂屢?1：2）2.在離心管中加入Ficoll，沿傾斜的管壁緩緩加入稀釋的外周血（Ficoll：稀釋血=1：2）3.離心：18℃~22℃，1500rpm，30min實(shí)驗(yàn)步驟4.將最上層血漿層吸棄，沿管壁周緣輕輕吸取PBMC層移入另一試管中實(shí)驗(yàn)步驟5.加足量稀釋液充分洗滌，1800rpm，離心10min，棄上清6.重復(fù)洗滌一次，1400rpm，

3、離心10min，棄上清7.適量的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞注意事項(xiàng)每毫升外周血大約可獲1×106單個(gè)核細(xì)胞Ficoll應(yīng)適量，外周血應(yīng)充分稀釋溫度直接影響到Ficoll的比重和分離效果在Ficoll上加入稀釋外周血時(shí)，應(yīng)緩慢加，以免沖散界面吸取單個(gè)核細(xì)胞層時(shí)，應(yīng)避免吸出過(guò)多的上清液或分層液而導(dǎo)致血小板污染等實(shí)驗(yàn)要求華氏管中加入血樣后，用記號(hào)筆作好標(biāo)記實(shí)驗(yàn)完畢后，請(qǐng)清洗試管、吸管和計(jì)數(shù)板思考題分離獲得的PBMC如何進(jìn)行計(jì)數(shù)？從PBMC中進(jìn)一步分離T、B淋巴細(xì)胞，可采用哪些方法？