補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離實(shí)驗(yàn).docx

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1、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)&人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離實(shí)驗(yàn)【補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)】一、實(shí)驗(yàn)原理：補(bǔ)體無特異性，可以與任何抗原抗體復(fù)合物結(jié)合而被激活，但是不能與單獨(dú)的抗原或抗體結(jié)合。補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)（CET）是一種有補(bǔ)體參與，以綿羊紅細(xì)胞和溶血素（抗綿羊紅細(xì)胞的抗體）作為知識(shí)系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)體系。綿羊紅細(xì)胞與溶血素結(jié)合后可激活補(bǔ)體。導(dǎo)致紅細(xì)胞破壞，出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。參與補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)的五種成分可以分為兩個(gè)系統(tǒng)。①待檢系統(tǒng)：已知抗原（或抗體）、待檢抗體（或抗原）。②指示系統(tǒng)：SRBC、溶血素。待檢系統(tǒng)與補(bǔ)體作用后，加入指示系統(tǒng)，若不出現(xiàn)溶血，表示待檢系統(tǒng)的抗原與抗體相對(duì)應(yīng)，兩者特異性結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物結(jié)合并消耗

2、了補(bǔ)體，無游離的補(bǔ)體與指示系統(tǒng)結(jié)合，故不溶血，為補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)陽性。反之，若出現(xiàn)溶血，則為補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)陰性。二、實(shí)驗(yàn)方法：1.取五支試管，依次做好標(biāo)記，放在試管架中。2.按照下表加樣。?試管號(hào)?待檢血清?抗原?補(bǔ)體?NS?搖勻?37攝氏度?水浴?15min???溶血素?SRBC?搖勻?37攝氏度?水浴?15min???結(jié)果?1試驗(yàn)管0.20.20.2——0.2?0.2?——?2血清對(duì)照0.2_0.20.20.2?0.2?溶血?3抗原對(duì)照-0.20.20.20.2?0.2?溶血?4補(bǔ)體對(duì)照--0.20.40.2?0.2?溶血?5SRBR對(duì)照---0.8—?0.2?不溶血三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

3、四、結(jié)果分析：1.羊血用前輕輕搖勻，避免劇烈正當(dāng)引起溶血。2.各種試劑的吸管不要混用。3.補(bǔ)體的性質(zhì)較不穩(wěn)定，低溫保存，加樣時(shí)再從冰箱里取出。4.水浴時(shí)避免水滴滴進(jìn)試管。5.本實(shí)驗(yàn)影響因素很多，對(duì)照組的反應(yīng)情況是否正常是判斷實(shí)驗(yàn)可信度的參照。6.本次試驗(yàn)結(jié)果如圖所示，其中1號(hào)試管和3號(hào)試管結(jié)果出現(xiàn)錯(cuò)誤，分析實(shí)驗(yàn)流程可知，可能是在水浴過程中混入水滴所致或?qū)嶒?yàn)過程中對(duì)試劑沒有搖勻。下次實(shí)驗(yàn)一定注意?！救送庵苎獑蝹€(gè)核細(xì)胞的分離實(shí)驗(yàn)】一、實(shí)驗(yàn)原理：分離PBMC的常用方法有物理方法（如密度梯度離心發(fā)、細(xì)胞比重法等）；化學(xué)方法（如低滲鹽水法、氯化銨溶紅細(xì)胞法）等。本次試驗(yàn)使用Ficoll-H

4、ypaque密度梯度離心法。這種方法中常用來分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離液是由聚蔗糖和泛影葡胺按一定比例混合制成。它分子量大又無化學(xué)活性，20攝氏度時(shí)比重約為1.077kg/L，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞比重略小于分層液，為1.070kg/L左右。而粒細(xì)胞和紅細(xì)胞比重大，為1.092kg/L左右。通過離心，使一定比重的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞位于分離液的上層，而粒細(xì)胞和紅細(xì)胞沉于離心管的管底，從而將淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞等單個(gè)核細(xì)胞分離出來。二、實(shí)驗(yàn)方法：1.抽取1.5ml靜脈血至肝素抗凝管，加入1.5mlHank’s液稀釋。2.混勻后取3ml稀釋液，沿試管壁緩慢加入到2m

5、l分離液中。2000rpm,離心20min。3.小心吸取淋巴細(xì)胞層，加入2mlHank’s液，2000rpm,離心10min。4.棄上清，加入2mlHank’s液。2000rpm,離心10min。5.棄上清，加入2mlHank’s液，制片觀察。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：四、實(shí)驗(yàn)分析：1、抽取人外周靜脈血的時(shí)候要注意無菌操作。還應(yīng)注意生物安全保護(hù)，避免血源性傳染病。2.操作全程應(yīng)盡可能在較短時(shí)間內(nèi)完成，以減少死細(xì)胞的數(shù)目。3.一定要用水平磚頭的離心機(jī)，且離心機(jī)轉(zhuǎn)速的增加和減少要均勻、平穩(wěn)，以保持細(xì)胞界面的清晰。4.注意血制品的污染。5、注意加入Hank’s液時(shí)不要打破界面。6.本次試驗(yàn)較為成功

6、，能清晰的觀察到人單核細(xì)胞。