外周血單個核細(xì)胞分離方法探討

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1、外周血單個核細(xì)胞分離方法探討作者：韓亞萍劉源章莉莉劉婷李軍黃祖瑚【關(guān)鍵詞】羥乙基淀粉【摘要】目的探討外周血單個核細(xì)胞（PBMC）的不同分離方法對分離效果、貼壁能力以及淋巴細(xì)胞的增殖活性的影響。方法取肝素抗凝血，分別用羥乙基淀粉（hydrixyethylstarch，HES）自然沉降法、HES離心沉淀法、Ficoll密度梯度離心法三種方法分離單個核細(xì)胞，直接進(jìn)行貼壁計數(shù)及多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（Cytokine-inducedkiller，CIK）培養(yǎng)。結(jié)果HES自然沉降法、HES離心沉淀法、Ficoll密度梯度離心法分離的PBMC回收率分

2、別為86.4%、86.0%、85.1%。結(jié)論羥乙基淀粉離心沉淀法可有效地分離PBMC。關(guān)鍵詞羥乙基淀粉淋巴細(xì)胞分離液單核細(xì)胞.【Abstract】ObjectiveToinvestigatethedifferenceamongthreeprotocolsofisolatingperipheralbloodmononuclearcells（PBMCs）throughobservingtherecoveryrate，theadherentabilityandlymphocytesproliferationacˉtivityoftheisolated

3、PBMCs.MethodsUsethreedifferentisolationprotocols，HES（hydrixyethylstarch）sedimentationmethod，HEScentrifugationmethodandFicolldensitygradientcentrifugation，toisolatePBMCsfromhealthydonors.ThenparetheseisolationprotocolsthroughobservingtherecoveryrateofPBMCs，thenumberofplastic-

4、adherentcellsandthecytokine-inducedkillercellsproliferation.ResultsTherecoveryrateofPBMCsis86.4%byHESsedimentationmethod，83.7%byHEScentrifugationandsedimentationmethodand85.1%byFicolldensitygradientcentrifugation［method］separately.ConclusionOurobservationprovideevidencethatH

5、EScentrifugationmethodcouldefficientlyisolatePBMCsfromhumanperipheralblood.Keyonocyte外周血單個核細(xì)胞分離效果直接影響細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果，經(jīng)典的Ficoll密度梯度常用于少量血液分離，而在血液較多時則須分成許多離心管，重復(fù)地開放操作增加了污染機(jī)會。為此，我們用HES離心沉淀法代替Ficoll密度梯度離心法分離PBMC，對不同方法獲取PBMC的貼壁能力和CIK細(xì)胞增殖活性等作一較為系統(tǒng)的探討。1材料和方法1.1材料外周血:健康成人外周血10份。Ficoll:上海試劑二廠

6、，分子量400000。6%HES:DUPONT公司生產(chǎn)，分子量480000。1.2方法1.2.1外周血單個核細(xì)胞的分離HES自然沉降法［1］:即肝素抗凝血與6%HES按5:1混合，自然沉降60min，取上層液400×g離心10min，以RPMI1640洗兩遍備用。HES離心沉淀法:分別將抗凝血與HES12:1、7:1、6:1、5:1、3:1、2:1，使HES終濃度為0.5%、0.85%、1.0%、1.2%、2.0%和3.0%條件下20℃60×g離心10min，取上層液400×g離心10min，以RPMI1640洗兩次備用。Ficoll密度梯度離

7、心法［2］:肝素抗凝血先與RPMI1640培養(yǎng)液1:1混合，再加等量淋巴細(xì)胞分離液600×g離心20min，小心吸取單個核細(xì)胞層，以RPMI1640洗兩遍備用。1.2.2PBMC的處理將不同分離方法獲取的PBMC計數(shù)后重懸于完全培養(yǎng)基中，分別加入24孔培養(yǎng)板，每孔4×106細(xì)胞，37℃，5%CO2培養(yǎng)2h后吸取培養(yǎng)上清，用RPMI1640輕輕洗滌培養(yǎng)孔3次以去除非貼壁細(xì)胞。收集貼壁細(xì)胞計數(shù)并用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體通過熒光激活細(xì)胞分離器（FACSVantageSE）鑒定。懸浮細(xì)胞用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml，補充適量的CD3單抗、

8、rh-IFN、IL-2等，共同培養(yǎng)多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK），每3天換液1次并計數(shù)，第10天收獲細(xì)胞，計算增殖倍數(shù)，同時以熒光素標(biāo)記的單克隆