單個核細胞的分離

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1、單個核細胞的分離.txt女人謹記：一定要吃好玩好睡好喝好。一旦累死了，就別的女人花咱的錢，住咱的房，睡咱的老公，泡咱的男朋友，還打咱的娃。單個核細胞的分離：（密度離心法）（一）外周血中的單個核細胞的分離：1.眼眶靜脈叢采血：（無菌條件下操作）采血者的左手拇食兩指從背部較緊地握住小鼠或大鼠的頸部(大鼠采血需帶上紗手套)，應防止動物窒息。當取血時左手拇指及食指輕輕壓迫動物的頸部兩側(cè)，使眶后靜脈叢充血。右手持續(xù)接7號針頭的1ml注射器或長頸(3～4cm)硬質(zhì)玻璃滴管(毛細管內(nèi)徑0.5-1.0mm)，使采血器與鼠面成45℃的夾角，由眼內(nèi)角刺入，

2、針頭斜面先向眼球，刺入后再轉(zhuǎn)180度使斜面對著眼眶后界。刺入濃度，小鼠約2～3mm。當感到有阻力時即停止推進，同時，將針退出約0.1-0.5mm，邊退邊抽。若穿刺適當血液能自然流入毛細管中，當?shù)玫剿璧难亢螅闯ゼ佑陬i部的壓力，同時，將采血器拔出，以防止術(shù)后穿刺孔出血。若技術(shù)熟練，用本法短期內(nèi)可重復采血均無多大困難。左右兩眼輪換更好。體重20-25g的小鼠每次可采血0.2-0.3ml。摘除眼球取血：左手抓住小鼠頸部皮膚，輕壓在實驗臺上，取側(cè)臥位，左手食指盡量將小鼠眼周皮膚往頸后壓，使眼球突出。用眼科彎鑷迅速夾去眼球，將鼠倒立，用器皿

3、接住流出的血液。采血完畢立即用紗布壓迫止血。每次采血量0.6-1mL。2.分離PBMC操作步驟：1）用抗凝管（內(nèi)含抗凝液0.2ml）收集血液，搖勻，加入的Hank’s液或PBS等體積（1:1）稀釋血液。或用肝素溶液：生理鹽水將肝素配成125-250U/mL的無菌液，4度保存。每1mL全血加0.1mL肝素溶液。2）取淋巴細胞分層液2ml，放入15ml的離心管。3）將離心管傾斜45°角，用吸管吸取稀釋血液，在離分層液面上1cm處，沿試管壁徐徐加入，使稀釋血液量疊于分層液上，保持兩者界面清晰。（稀釋血液與分層液體積比例約為2:1）。（或：將吸

4、管嘴插入離心管底部，將分層液緩慢加入稀釋血液的底部。）4）18-20度，水平離心機以2000r/min離心20min，離心后其中的內(nèi)容物分為四層，上層為血漿（內(nèi)含血小板），中間層為分層液，底層為紅細胞和粒細胞，在上、中層液體界面處可見到乳白色混濁的單個核細胞層（?。蝹€核細胞包括淋巴細胞和單核細胞。（離心溫度在18-20度）5）用毛細血管（或1ml注射器）輕輕插入白膜層，沿試管壁周緣吸取界面層單個核細胞，移入另一離心管中。（或：先吸去最上層的血漿，然后用另一只毛細吸管收集血漿層和淋巴細胞分離液交界面的單個核細胞，盡量全部吸出PBMC，

5、避免吸到過多的分層液和血漿。）6）加入５ml的（不含Ca2+，Mg2+）的Hank's液或RPMI1640洗滌2次，混勻，依次以1500r/min、1000r/min離心10min，吸棄上清。（*低速離心有利于去除細胞懸液中留存的血小板）7）末次離心后，棄上清，用含有10％小牛血清的RPMI16402ml，重懸細胞。8)細胞計數(shù)：取20ul細胞懸液加20ul0.4%臺盼蘭染液，3-5分鐘后取樣進行計數(shù)?；罴毎恢?，折光強；死細胞被然成藍色，體積略膨大。計數(shù)200個細胞，計算活細胞百分率。單個核細胞濃度(細胞數(shù)／1ml細胞懸液)＝(4個

6、大方格內(nèi)細胞總數(shù)/4)×10４×2(稀釋倍數(shù))活細胞百分率＝(活細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100％　　用本法分離PBMC，純度在90％以上，收獲率可達80～90％，活細胞百分率在95％以上。3-5毫升外周血可得1×106～2×106PBMC（人）。鼠可得0.5-1×106PBMC左右kentj發(fā)貼:61積分:2得票:1狀態(tài):離線丁當:107個人資料發(fā)短消息2008-08-3018:24--------------------------------------------------------------------------------

7、這是我做得步驟比較成熟可以參--------------------------------------------------------------------------------------------------------------網(wǎng)上搜到的，請問是常規(guī)方法嗎？Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞測定細胞免疫功能首先要從人或動物外周血或組織中獲取有活性的細胞，如淋巴細胞、巨噬細胞、粒細胞等。取得有活性的細胞應根據(jù)不同目的，采用不同方法，考慮(1)細胞純度；(2)細胞獲得量；(3)細胞活力；(4)使用方法的簡易程

8、度和本室條件等。目前常用Ficoll密度梯度離心法直接分離和純化外周血單個核細胞?！　?一)　原理:　　常用來分離人外周血單個核細胞（PBMC）的分層液比重是1.077±0.001的聚蔗糖(Ficoll)-