單個(gè)核細(xì)胞的分離

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1、單個(gè)核細(xì)胞的分離.txt女人謹(jǐn)記：一定要吃好玩好睡好喝好。一旦累死了，就別的女人花咱的錢，住咱的房，睡咱的老公，泡咱的男朋友，還打咱的娃。單個(gè)核細(xì)胞的分離：（密度離心法）（一）外周血中的單個(gè)核細(xì)胞的分離：1.眼眶靜脈叢采血：（無菌條件下操作）采血者的左手拇食兩指從背部較緊地握住小鼠或大鼠的頸部(大鼠采血需帶上紗手套)，應(yīng)防止動(dòng)物窒息。當(dāng)取血時(shí)左手拇指及食指輕輕壓迫動(dòng)物的頸部兩側(cè)，使眶后靜脈叢充血。右手持續(xù)接7號針頭的1ml注射器或長頸(3～4cm)硬質(zhì)玻璃滴管(毛細(xì)管內(nèi)徑0.5-1.0mm)，使采血器與鼠面成45℃的夾角，由眼內(nèi)角刺入，

2、針頭斜面先向眼球，刺入后再轉(zhuǎn)180度使斜面對著眼眶后界。刺入濃度，小鼠約2～3mm。當(dāng)感到有阻力時(shí)即停止推進(jìn)，同時(shí)，將針退出約0.1-0.5mm，邊退邊抽。若穿刺適當(dāng)血液能自然流入毛細(xì)管中，當(dāng)?shù)玫剿璧难亢?，即除去加于頸部的壓力，同時(shí)，將采血器拔出，以防止術(shù)后穿刺孔出血。若技術(shù)熟練，用本法短期內(nèi)可重復(fù)采血均無多大困難。左右兩眼輪換更好。體重20-25g的小鼠每次可采血0.2-0.3ml。摘除眼球取血：左手抓住小鼠頸部皮膚，輕壓在實(shí)驗(yàn)臺上，取側(cè)臥位，左手食指盡量將小鼠眼周皮膚往頸后壓，使眼球突出。用眼科彎鑷迅速夾去眼球，將鼠倒立，用器皿

3、接住流出的血液。采血完畢立即用紗布壓迫止血。每次采血量0.6-1mL。2.分離PBMC操作步驟：1）用抗凝管（內(nèi)含抗凝液0.2ml）收集血液，搖勻，加入的Hank’s液或PBS等體積（1:1）稀釋血液?；蛴酶嗡厝芤海荷睇}水將肝素配成125-250U/mL的無菌液，4度保存。每1mL全血加0.1mL肝素溶液。2）取淋巴細(xì)胞分層液2ml，放入15ml的離心管。3）將離心管傾斜45°角，用吸管吸取稀釋血液，在離分層液面上1cm處，沿試管壁徐徐加入，使稀釋血液量疊于分層液上，保持兩者界面清晰。（稀釋血液與分層液體積比例約為2:1）。（或：將吸

4、管嘴插入離心管底部，將分層液緩慢加入稀釋血液的底部。）4）18-20度，水平離心機(jī)以2000r/min離心20min，離心后其中的內(nèi)容物分為四層，上層為血漿（內(nèi)含血小板），中間層為分層液，底層為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，在上、中層液體界面處可見到乳白色混濁的單個(gè)核細(xì)胞層（薄）。單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。（離心溫度在18-20度）5）用毛細(xì)血管（或1ml注射器）輕輕插入白膜層，沿試管壁周緣吸取界面層單個(gè)核細(xì)胞，移入另一離心管中。（或：先吸去最上層的血漿，然后用另一只毛細(xì)吸管收集血漿層和淋巴細(xì)胞分離液交界面的單個(gè)核細(xì)胞，盡量全部吸出PBMC，

5、避免吸到過多的分層液和血漿。）6）加入５ml的（不含Ca2+，Mg2+）的Hank's液或RPMI1640洗滌2次，混勻，依次以1500r/min、1000r/min離心10min，吸棄上清。（*低速離心有利于去除細(xì)胞懸液中留存的血小板）7）末次離心后，棄上清，用含有10％小牛血清的RPMI16402ml，重懸細(xì)胞。8)細(xì)胞計(jì)數(shù)：取20ul細(xì)胞懸液加20ul0.4%臺盼蘭染液，3-5分鐘后取樣進(jìn)行計(jì)數(shù)?；罴?xì)胞不著色，折光強(qiáng)；死細(xì)胞被然成藍(lán)色，體積略膨大。計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算活細(xì)胞百分率。單個(gè)核細(xì)胞濃度(細(xì)胞數(shù)／1ml細(xì)胞懸液)＝(4個(gè)

6、大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)/4)×10４×2(稀釋倍數(shù))活細(xì)胞百分率＝(活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100％　　用本法分離PBMC，純度在90％以上，收獲率可達(dá)80～90％，活細(xì)胞百分率在95％以上。3-5毫升外周血可得1×106～2×106PBMC（人）。鼠可得0.5-1×106PBMC左右kentj發(fā)貼:61積分:2得票:1狀態(tài):離線丁當(dāng):107個(gè)人資料發(fā)短消息2008-08-3018:24--------------------------------------------------------------------------------

7、這是我做得步驟比較成熟可以參--------------------------------------------------------------------------------------------------------------網(wǎng)上搜到的，請問是常規(guī)方法嗎？Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞測定細(xì)胞免疫功能首先要從人或動(dòng)物外周血或組織中獲取有活性的細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞等。取得有活性的細(xì)胞應(yīng)根據(jù)不同目的，采用不同方法，考慮(1)細(xì)胞純度；(2)細(xì)胞獲得量；(3)細(xì)胞活力；(4)使用方法的簡易程

8、度和本室條件等。目前常用Ficoll密度梯度離心法直接分離和純化外周血單個(gè)核細(xì)胞?！　?一)　原理:　　常用來分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的分層液比重是1.077±0.001的聚蔗糖(Ficoll)-