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1、實驗二十四外周血單個核細胞的分離?(Separationofmononuclearcellinperipheralblood)???免疫細胞是一組不均一的細胞群體，它包括T、B淋巴細胞、NK細胞、單核細胞/巨噬細胞以及粒細胞等，這些細胞的生物學特性，如細胞的大小、密度、表面電荷、黏附能力以及細胞表面的分子標志等均存在差異，借助這些差異可區(qū)分不同的細胞類別。外周血單個核細胞(PBMC)的分離主要有兩種方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分離法和聚乙烯吡咯烷酮硅膠(Percoll)分離法。此處只介紹聚蔗糖
2、-泛影葡胺分離法?！緦嶒炘怼垦褐袉蝹€核細胞的分離常采用密度梯度離心法。市售淋巴細胞分離液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque)按一定比例混合制成，20℃密度為1.077±0.001，單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞，其密度為1.050～1.077，而粒細胞和紅細胞的密度為1.080～1.110。將待分離的細胞懸液小心鋪于淋巴細胞分離液上，經(jīng)離心后單個核細胞懸浮于分離液上層界面，而紅細胞與粒細胞沉于管底。【主要試劑和器材】1.聚蔗糖-泛影葡胺分層液?密度為1.077±0.001。2.5g/L臺盼藍。3.
3、250U/ml肝素溶液?用Hank,s液配制。4.Hank,s液。5.注射器、刻度離心管、吸管、滴管、血細胞計數(shù)板、載玻片、蓋玻片。6.水平離心機、顯微鏡。【操作方法】1.抽取靜脈血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的無菌試管中搖勻，作白細胞計數(shù)和分類計數(shù)。再加入等量Hank,s液混勻。2.取2ml分層液置于離心管中，將稀釋血液沿管壁緩緩疊加于分層液上，形成清晰界面。稀釋血液與分層液的容積比例以2∶1～3∶1為宜。3.置水平離心機中，2000r/min離心20min。4.離心后從離心管的底部到液面分為四層，依次為紅細胞和
4、粒細胞層、分層液層、單個核細胞層、血漿層(含血小板和破碎細胞)。5.用滴管直接吸出單個核細胞層，或吸去血漿層后再吸了該層，置于另一離心管中。6.加入4倍量以上的Hank,s液，充分混勻，1000r／min離心l0min。離心后傾棄上清液，再用Hank,s液洗2次。7.用含10%～20%滅活小牛血清的Hank,s液或培養(yǎng)液配制細胞懸液。計數(shù)，并分別計數(shù)粒細胞和單個核細胞數(shù)，同時用臺盼藍檢測細胞活力，最后按實驗要求將細胞懸液調(diào)整到適當濃度?！窘Y(jié)果判斷】【注意事項】1.將血液進行稀釋可降低血液黏稠度和紅細胞的聚集，提高單個核細
5、胞的收獲量。2.溫度變化可直接影響分層液的密度，即影響細胞的收獲率和純度。故應(yīng)在室溫(18～25℃)下進行實驗，分層液使用前應(yīng)預溫至室溫。溫度過低，淋巴細胞丟失增多；溫度過高，會影響淋巴細胞活性。3.分離時的轉(zhuǎn)速與時間應(yīng)根據(jù)不同樣品作相應(yīng)調(diào)整。離心速度在2000～2500r/min，離心時間為l5～20min，離心后若見白霧狀細胞層中仍摻雜紅細胞，應(yīng)提高轉(zhuǎn)速或延長離心時間，若淋巴細胞丟失過多，則應(yīng)適當降低轉(zhuǎn)速或離心時間。4.分層液應(yīng)直接加入管底，防止浸沾四周管壁。5.將細胞懸液疊加于分層液上時務(wù)必小心，不要擾亂界面以影響
6、分離效果。6.充分冼滌分離后的單核細胞，可除去大部分混雜的血小板?！緫?yīng)用與評價】本方法操作簡便、穩(wěn)定。細胞回收率達80%～90%，單個核細胞純度可達95%，淋巴細胞約占90%～95%，細胞活力可達95%以上。但其中仍可混雜少量(約10%)其它細胞。該方法是目前最理想、最常用分離淋巴細胞的手段，其制備的細胞(主要是淋巴細胞)懸液已能滿足許多細胞免疫試驗要求，也可用于進一步制備T細胞、B細胞及單核細胞。故在細胞免疫試驗中有廣泛應(yīng)用，是細胞免疫檢測中最基本的技術(shù)之一。【思考題】1.為何常用密度為1.077土0.001的分層液分
7、離人單個核細胞？2.利用密度梯度離心法分離人單個細胞，為何要將血液樣品進行適當稀釋，并要疊加于分層液上？外周血單個核細胞的分離—密度梯度離心法一、原理根據(jù)物理學中顆粒沉降原理，不同密度的物質(zhì)顆粒在其沉降運動中可因其比重的差別而處于不同的分布位置。利用此原理可設(shè)計一定比重的液體界面，將外周血中各種不同比重的細胞通過離心沉降而達到使其彼此分離的目的。已知人類淋巴細胞和單核細胞的比重大約在1.075~1.090之間，而紅細胞與粒細胞的比重均大于1.090。因此，若用比重為1.077±0.001的分離液則可通過密度梯度離心方法，
8、在分離液界面上收集外周血單個核細胞。?二、器材與試劑器材：（1）水平式離心機（2）顯微鏡（3）血球計數(shù)板、血蓋片（4）載玻片、蓋玻片（5）定量移液器、洗耳球（6）刻度離心管（7）試管、滴管、橡皮滴頭（8）小濾紙、擦鏡紙?試劑：（1）抗凝全血（臨時抽取）、40倍稀釋的全血（計數(shù)用）（2）淋巴細胞分離液（市售，比重：1.
