基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究道地藥材當(dāng)歸同源基因.pdf

《基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究道地藥材當(dāng)歸同源基因.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫(kù)。

1、·4lO·中國(guó)中醫(yī)藥科技2014年7月第21卷第4期July2014Vo1．21No．4基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究道地藥材當(dāng)歸同源基因王金權(quán)楊杰練成丁維俊李煒弘王米渠(平?jīng)鲠t(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?！て?jīng)?44000成都中醫(yī)藥大學(xué)·成都610075)摘要目的：通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)全方位、深層次挖掘甘肅岷縣當(dāng)歸的基因組資源，并進(jìn)行當(dāng)歸同源基因分析，為當(dāng)歸栽培、品種鑒定、加工、配伍及保健品開(kāi)發(fā)提供理論支撐。方法：岷縣現(xiàn)場(chǎng)采集當(dāng)歸樣品，并經(jīng)專家鑒定為當(dāng)歸品種(angelicasinensis(oliv．)diels)。采用RNAplantP

2、lus方法提取岷歸頭、岷歸尾的總RNA，質(zhì)量鑒定合格后構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。測(cè)序文庫(kù)檢測(cè)合格后在IUumminaHiSeq2000測(cè)序儀上完成雙端測(cè)序。采用相關(guān)生物信息學(xué)分析軟件，實(shí)現(xiàn)研究目標(biāo)。結(jié)果：①通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，獲取了63585個(gè)當(dāng)歸表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)，構(gòu)建了當(dāng)歸的基因組。②在UniProt(date：2012．09)數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋的30432個(gè)當(dāng)歸基因，分布于939種物種；其中序列分布頻率較高的前5種物種為葡萄、蓖麻、毛果楊、大豆、苜蓿屬。結(jié)論：當(dāng)歸基因組研究處于起步階段，亟待深入研究。已注釋基因主要分布于目前研

3、究較深入的5種重要經(jīng)濟(jì)植物，成為當(dāng)歸制劑與保健品開(kāi)發(fā)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)當(dāng)歸同源基因道地藥材當(dāng)歸為“血中之圣藥”，是使用頻率最高的中藥之一，1．3序列組裝有“十方九歸”、“藥王”之譽(yù)。我國(guó)第一部本草學(xué)著作《神農(nóng)1．3．1原始序列組裝(primaryunigenesassembly)將樣本本草經(jīng)》中，列其為既能祛邪又可補(bǔ)虛之品】?！毒霸廊珪?shū)測(cè)序數(shù)據(jù)讀本，應(yīng)用CLCGenomicsWorkbench(version：5．5)·本草正》：“當(dāng)歸，其味甘而重，故專能補(bǔ)血；其氣輕而辛，的scaffoldingc

4、ontig算法進(jìn)行從頭合成拼接，采用參數(shù)：word—故又能行血。補(bǔ)中有動(dòng)，行中有補(bǔ)，誠(chéng)血中之氣藥，亦血中之size=45，minimumcontiglength≥200。此階段拼接得出的圣藥也”。當(dāng)歸藥效成分豐富，具補(bǔ)血、養(yǎng)血、活血等功效。序列稱之為primaryunigenes。其主要成份Z一藁苯內(nèi)酯、阿魏酸及香豆素葡萄糖苷等為活1．3．2最終序列組裝(Finalunigenesassembly)應(yīng)用血化瘀的物質(zhì)基礎(chǔ)，表現(xiàn)為抗血小板聚集和抗凝活性；CAP3EST拼接軟件對(duì)得到的primaryunigenes進(jìn)行混合拼

5、而當(dāng)歸多糖可抗凝血及止血，起雙向調(diào)節(jié)作用J，也兼具補(bǔ)接，得到一個(gè)finalunigenes集合。采用cap3軟件的策略為：血養(yǎng)血功能“。但是，當(dāng)歸藥效成分形成的生物學(xué)基礎(chǔ)仍對(duì)primaryunigenes進(jìn)行兩次拼接，第一個(gè)使用寬松拼接參缺乏研究。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)作為開(kāi)放性研究平臺(tái)，尤其適用數(shù)進(jìn)行初始拼接，第二次使用嚴(yán)格拼接參數(shù)進(jìn)行拼接。于當(dāng)歸等基因組研究薄弱物種，可構(gòu)建當(dāng)歸的基因組研究資1．4Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋將得到的finalunigenes序列源，可從直系同源基因的角度發(fā)現(xiàn)與當(dāng)歸有密切關(guān)系的物與UniPr

6、ot(date：2012．09)庫(kù)進(jìn)行blastx比對(duì)(將核酸序列翻種，為當(dāng)歸研發(fā)提供理論支撐。譯為蛋白，再進(jìn)行比對(duì))，UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)是目前對(duì)蛋白功能1材料與方法結(jié)構(gòu)注釋最為詳細(xì)且準(zhǔn)確的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，大概包括1．1樣品收集與鑒定2012年10月中旬于甘肅岷縣清水22000000個(gè)蛋白，這里采用trEMBL+swissprot。最后得到比鄉(xiāng)收集代表性當(dāng)歸樣品(angelicasinensis(oliv．)diels)，并由對(duì)結(jié)果，篩選條件：E—value<1e～。平?jīng)鲠t(yī)專藥用植物學(xué)教授現(xiàn)場(chǎng)完成當(dāng)歸鑒定。立即取當(dāng)歸2結(jié)

7、果頭、當(dāng)歸尾各0．5g，共10個(gè)，分別編號(hào)、錫箔紙包裝，并投入2．1轉(zhuǎn)錄組測(cè)序產(chǎn)出、序列組裝由IⅡuminaHiSeq2000液氮中保存，干冰運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。高通量測(cè)序獲得62539584個(gè)讀序。由這些短讀序組裝出1．2轉(zhuǎn)錄組測(cè)序從甘肅岷縣當(dāng)歸頭、當(dāng)歸尾中提取總11076個(gè)eontig，平均長(zhǎng)度為556bp。因后續(xù)注釋分析都基于RNA，經(jīng)ND一1000分光光度計(jì)及AgilentBioanalyzer2100電unigene，由CLCGenomicsWorkbench(version：5．5)的scafol—泳檢測(cè)RNA提

8、取質(zhì)量。當(dāng)歸頭、當(dāng)歸尾總RNA混合后，用dingcontig算法進(jìn)行從頭合成拼接得出的序列為primaryRNeasyMicrokit按其操作流程純化20g總RNA，所得產(chǎn)物unigenes，再由CAP3EST拼接軟件對(duì)得到的primaryunigenes用于測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建；測(cè)序文庫(kù)經(jīng)Qubit⑩2．0Fluorometer和進(jìn)行混