酶的定向進(jìn)化.ppt

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1、第八章酶的定向進(jìn)化8.1簡(jiǎn)介通?？赏ㄟ^(guò)兩條途徑獲得具有新功能和特性的酶一是從大量未知的生物種系中尋找；二是改造現(xiàn)有已知的酶。人工改造之定點(diǎn)突變首先分析蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)，搞清結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，然后采用定點(diǎn)突變技術(shù)改變蛋白質(zhì)中的個(gè)別氨基酸殘基，從而得到新的蛋白質(zhì)，理性化設(shè)計(jì)。定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)天然酶蛋白的催化活性、抗氧化性、底物特異性、熱穩(wěn)定性及拓寬酶反應(yīng)的底物范圍、改進(jìn)酶的別構(gòu)效應(yīng)等進(jìn)行了成功的改造。定點(diǎn)突變的缺點(diǎn)只能對(duì)天然酶蛋白中少數(shù)的氨基酸殘基進(jìn)行替換、刪除或插入，不改變酶蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)，因而對(duì)酶

2、功能的改造較有限。本法僅適用于三維結(jié)構(gòu)清楚、結(jié)構(gòu)和功能的相互關(guān)系也較清楚的酶。當(dāng)對(duì)酶結(jié)構(gòu)不甚了解時(shí)，定點(diǎn)突變就無(wú)能為力了.定向進(jìn)化利用基因的可操作性，模擬自然界的演化進(jìn)程的非合理設(shè)計(jì)方案,定向進(jìn)化(directedevolution)、雜合進(jìn)化(hybridevolution)等。定義:酶的體外定向進(jìn)化(invitrodirectedevolution)是在人工模擬自然進(jìn)化過(guò)程的條件下，通過(guò)容錯(cuò)PCR、DNA改組、交錯(cuò)延伸技術(shù)、隨機(jī)引物引導(dǎo)重組和遞增截短技術(shù)等方法對(duì)編碼酶的基因進(jìn)行突變和體外重組，經(jīng)

3、高通量篩選獲得性能更優(yōu)良或全新的酶。本法不需了解酶的結(jié)構(gòu)信息，因此稱為非理性化設(shè)計(jì)。定向進(jìn)化的歷史1萌芽階段首先在分子水平上進(jìn)行改造單一分子的是SolSpiegelman在20世紀(jì)60年代,利用RNA噬菌體Q進(jìn)行的試驗(yàn),目的是證明達(dá)爾文的自然選擇也可在非細(xì)胞體進(jìn)行.病毒基因組?Q復(fù)制酶擴(kuò)增?DNA突變庫(kù)?復(fù)制快的保留(能被Q酶選擇識(shí)別的)2奠基階段1981年，HallBG等報(bào)道了他們定向改變了大腸桿菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物專一性，開(kāi)發(fā)出對(duì)幾種糖苷鍵有水解能力的酶。HallBG等利用lacz缺

4、陷型的菌株為宿主菌，分別在含有某種碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)．從酶的自發(fā)突變庫(kù)中篩選出分別可以水解半乳糖、乳果糖、乳糖酸的突變酶，而野生型的酶不能水解這些底物。3發(fā)展階段易錯(cuò)PCR(error-pronePCR)和DNA改組方法被成功開(kāi)發(fā),標(biāo)志著酶分子定向進(jìn)化技術(shù)的成熟.1992年GramH．等用噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)體外篩選抗體時(shí)，用易錯(cuò)PCR向抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)引入突變。Stemmer將DNA改組方法引用到酶分子定向進(jìn)化中，他用β內(nèi)酰胺酶作為模型分子，對(duì)其正向突變庫(kù)進(jìn)行DNA改組，以逐漸增加頭孢氨噻的

5、濃度為篩選壓力，經(jīng)過(guò)三輪DNA改組獲得酶活力增加32000倍的突變體。8.2酶的定向進(jìn)化常用方法一、易錯(cuò)PCR技術(shù)為代表的無(wú)性進(jìn)化二、DNA改組技術(shù)為代表的有性進(jìn)化一、易錯(cuò)PCR技術(shù)為代表的無(wú)性進(jìn)化無(wú)性突變是向單一酶分子基因內(nèi)隨機(jī)引入突變，制造突變酶庫(kù)以便篩選。主要的手段包括易錯(cuò)PCR、盒式誘變、隨機(jī)定位誘變等易錯(cuò)PCR是在采用Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，通過(guò)調(diào)整反應(yīng)條件，例如提高鎂離子濃度，加入錳離子．改變體系中四種dNTP的濃度等，使用低保真度的Taq酶，從而向目的基因中．以一定的頻率隨機(jī)

6、引入突變構(gòu)建突變庫(kù)，然后選擇或篩選需要的突變體。易錯(cuò)PCR遺傳變化只發(fā)生在單一分子內(nèi)部,屬于無(wú)性進(jìn)化。較為費(fèi)力、耗時(shí),一般多用于較小基因片段(<800bp)的改造。通常,經(jīng)一輪的易錯(cuò)PCR、定向篩選,很難獲得令人滿意的結(jié)果。由此發(fā)展出了連續(xù)易錯(cuò)PCR(Sequentialerror-pronePCR),將一次PCR擴(kuò)增得到的有益突變基因作為下一次PCR擴(kuò)增的模板,連續(xù)反復(fù)進(jìn)行隨機(jī)誘變,使得每一次獲得的少量突變累積而產(chǎn)生重要的有益突變。實(shí)例枯草桿菌蛋白酶:洗滌劑合成、鞣革和醫(yī)藥領(lǐng)域的重要工業(yè)酶制劑。C

7、hen和Arnold]采用易錯(cuò)PCR對(duì)該酶進(jìn)行了體外進(jìn)化研究。他們通過(guò)降低反應(yīng)體系中dATP的濃度,對(duì)編碼該酶從第49位氨基酸到C端的DNA片段進(jìn)行易錯(cuò)PCR,經(jīng)篩選得到的幾個(gè)突變株在高濃度的二甲基甲酰胺(DMF)中酶活性明顯提高突變體PC3在60%的DMF中,酶活力是野生型的256倍。將PC3再進(jìn)行兩個(gè)循環(huán)的定向進(jìn)化,得到的突變體13M酶活力比PC3還要高3倍?；瘜W(xué)誘變劑介導(dǎo)Taguchi等研究表明，用羥胺（hydroxylamine）在65℃下直接處理帶有目的基因片段的質(zhì)粒也可產(chǎn)生隨機(jī)突變，然后

8、用限制性內(nèi)切酶切下突變的基因片段，克隆到一定的表達(dá)載體中進(jìn)行功能篩選。應(yīng)用此技術(shù)將帶有枯草桿菌蛋白酶基因的質(zhì)粒進(jìn)行隨機(jī)突變，經(jīng)酶切、克隆表達(dá)后得到13個(gè)突變株，在10℃下其Kcat/Km比出發(fā)菌株提高1倍。由致突變株產(chǎn)生Greener等構(gòu)建了一株DNA修復(fù)途徑缺陷的大腸桿菌突變株XL1-Red，其體內(nèi)的DNA突變率比野生型高出5000倍。將帶有擬突變基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到XL1-Red菌株內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜，可產(chǎn)生隨機(jī)突變，頻率一般為1/2000。本法產(chǎn)生的隨機(jī)突變的特點(diǎn)為：（1）