《酶定向進(jìn)化》PPT課件

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1、第八章酶定向進(jìn)化天然酶的局限天然酶的穩(wěn)定性差,活性低使催化效率很低,還缺乏有商業(yè)價值的催化功能天然酶的局限性源于酶的自然進(jìn)化過程.現(xiàn)代生物工程的要求能具備長期穩(wěn)定性和活性能適用于水及非水相環(huán)境能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物能夠在特殊環(huán)境中合成和拆分制作新藥物或藥物的原材料如何利用相對簡單的方法以達(dá)到對天然酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶就顯得非常有研究意義和應(yīng)用前景.1993年,美國科學(xué)家ArnoldFH首先提出酶分子的定向進(jìn)化的概念,并用于天然酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶.酶分子定向進(jìn)化簡稱酶定向進(jìn)化，是模擬自然進(jìn)化過程（隨機(jī)突變和自然選擇），在體外進(jìn)行酶基因

2、的人工隨機(jī)突變，建立突變基因文庫，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有優(yōu)良催化特征的酶的突變體的技術(shù)過程。酶定向進(jìn)化的基本過程隨機(jī)突變、構(gòu)建突變基因文庫、定向選擇酶定向進(jìn)化的基本過程：酶基因隨機(jī)突變構(gòu)建突變基因文庫篩選負(fù)突變基因正突變基因進(jìn)化酶反復(fù)進(jìn)行第一節(jié)酶定向進(jìn)化的特點1.適應(yīng)面廣不需了解酶的結(jié)構(gòu)信息，因此稱為非理性化設(shè)計。2.目的性強(qiáng)3.效果顯著第二節(jié)酶基因的隨機(jī)突變體外隨機(jī)突變的方法：PCR技術(shù)、DNA重排技術(shù)、基因家族重排技術(shù)基因隨機(jī)突變方法的特點P207表8－1一易錯PCR技術(shù)可以通過提高鎂離子濃度、添加一定濃度的錳離子、改變4種底物（dAMP、dTMP

3、、dCMP、dGMP）的濃度比等反應(yīng)條件，使DNA聚合酶在催化基因擴(kuò)增時，增加堿基配對錯誤的出現(xiàn)頻率，而引起基因突變。特點正突變的概率低，突變基因文庫較大，文庫篩選的工作量大，一般適用于較小基因的定向進(jìn)化。實例枯草桿菌蛋白酶:洗滌劑合成、鞣革和醫(yī)藥領(lǐng)域的重要工業(yè)酶制劑。Chen等采用易錯PCR對該酶進(jìn)行了體外進(jìn)化研究。他們通過降低反應(yīng)體系中dATP的濃度,對編碼該酶從第49位氨基酸到C端的DNA片段進(jìn)行易錯PCR,經(jīng)篩選得到的幾個突變株在高濃度的二甲基甲酰胺(DMF)中酶活性明顯提高突變體PC3在60%的DMF中,酶活力是野生型的256倍。將PC3再進(jìn)行兩個循環(huán)的定向進(jìn)化,

4、得到的突變體13M酶活力比PC3還要高3倍。二DNA重排技術(shù)概念：又稱為DNA改組技術(shù)，是從正突變基因文庫中分離得到的同源DNA，用酶切割成隨機(jī)片斷，經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列重新排布而引起基因突變的技術(shù)過程。DNA重排技術(shù)的基本過程兩條以上正突變基因DNA隨機(jī)片斷突變基因構(gòu)建突變基因文庫篩選負(fù)突變基因正突變基因進(jìn)化酶酶切（反復(fù)進(jìn)行）無引物PCR基因重組酶切三基因家族重排技術(shù)又稱為基因家族改組技術(shù)，是從基因家族的若干同源基因出發(fā)，用酶(DNaseⅠ)切割成隨機(jī)片斷，經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列發(fā)生重新排布而引起基因突變的技術(shù)過程?；?/p>

5、因家族重排技術(shù)的基本過程基因家族若干同源基因酶切DNA隨機(jī)片斷突變基因突變基因文庫基因重組篩選負(fù)突變基因正突變基因進(jìn)化酶無引物PCR酶切反復(fù)進(jìn)行DNA家族重排技術(shù)與DNA重排技術(shù)的異同點相同點：DNA家族重排技術(shù)與DNA重排技術(shù)的過程大致相同，都要經(jīng)過基因的隨機(jī)切割、無引物PCR等步驟以獲得突變基因，然后經(jīng)過構(gòu)建突變基因文庫、采用高通量篩選技術(shù)篩選獲得正突變基因。不同點：DNA家族重排技術(shù)從基因家族的若干同源基因出發(fā)進(jìn)行DNA序列的重新排布，而后者則從采用易錯PCR等技術(shù)所獲得的兩個以上的正突變基因出發(fā)進(jìn)行DNA序列的重新排布。第三節(jié)酶突變基因的定向選擇突變基因的定向選擇基

6、本過程突變基因基因載體突變基因文庫基因重組篩選目的基因一、構(gòu)建突變基因文庫的主要過程載體的選擇1）質(zhì)粒載體：微生物細(xì)胞染色體外，閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子。2）噬菌體DNA載體：由噬菌體DNA改造而成的具有自我復(fù)制能力的載體。3）黏粒載體：是一類人工構(gòu)建的含有λDNA黏性末端和質(zhì)粒復(fù)制子的質(zhì)粒載體，又稱為柯斯質(zhì)粒。4）噬菌粒載體：是一類人工構(gòu)建的由M13噬菌體單鏈DNA的基因間隔區(qū)與質(zhì)粒載體結(jié)合而成的基因載體。基因重組在體外通過DNA連接酶的作用，將基因與載體連接在一起形成重組DNA的技術(shù)過程。黏性末端連接平頭末端連接修飾末端連接形成基因文庫將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞或包裝成有感

7、染活性的噬菌體的過程。重組質(zhì)粒載體：轉(zhuǎn)化重組噬菌體DNA載體：需要用噬菌體外殼蛋白將重組DNA進(jìn)行包裝，稱為有感染活性的重組噬菌體，而形成基因文庫。二、突變基因的篩選（一）定向選擇環(huán)境條件的設(shè)定（1）提高酶的穩(wěn)定性，高溫篩選重組細(xì)胞，每一次突變－篩選的循環(huán)中逐步提高重組細(xì)胞的培養(yǎng)溫度。（2）如果定向進(jìn)化的目的是提高β－內(nèi)酰胺酶的活性，從而提高對β－內(nèi)酰胺酶類抗生素的耐受性，可以通過在含有一定濃度的β－內(nèi)酰胺酶類抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組細(xì)胞，并在每一次突變－篩選循環(huán)中逐步提高抗生素的濃度。（二）高通量篩選技術(shù)P217