酶定向進(jìn)化論文--糖基轉(zhuǎn)移酶定向進(jìn)化研究進(jìn)展

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1、糖基轉(zhuǎn)移酶定向進(jìn)化研究進(jìn)展摘　要：糖基轉(zhuǎn)移酶在改造含糖活性化合物以獲得結(jié)構(gòu)多樣性過程中起著重要作用，定向進(jìn)化不僅能夠提高其對底物的寬泛性，同時(shí)也能夠提高其催化活性。定向進(jìn)化的成功與否取決于突變體庫的多樣性及篩選方法的可靠性和效率。本文簡要綜述了糖基轉(zhuǎn)移酶隨機(jī)突變方法及高通量篩選正突變體的策略，包括基于細(xì)胞的篩選法、基于熒光受體高通量篩選和pH值指示計(jì)高通量篩選。關(guān)鍵詞：糖基轉(zhuǎn)移酶；定向進(jìn)化；高通量篩選在自然界中存在的許多含糖小分子物質(zhì)(糖苷類化合物)具有生物活性，在目前臨床應(yīng)用的藥物中，很多都來自這類小分子物質(zhì)。而這些小分子結(jié)構(gòu)中的糖基的多樣性和在分子中的不同位置，往往對

2、這類化合物的生物活性是至關(guān)重要的。改造糖分子的結(jié)構(gòu)，使其具有生物活性、藥用價(jià)值，這為含糖藥物篩選工作提供了一條重要途徑。糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferase,GTs)參與糖苷類化合物生物合成，是對糖分子進(jìn)行生物學(xué)方法改造的重要對象[1](表1)。GTs催化不同的糖基與特定的受體分子結(jié)合，從而產(chǎn)生大量的寡糖、多聚糖和其他結(jié)構(gòu)多樣性的糖苷類化合物。但是，由于糖基轉(zhuǎn)移酶獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制，決定了該酶具有高度的底物特異性而限制了多樣性糖基的轉(zhuǎn)移，以致難以獲得結(jié)構(gòu)多樣性的糖苷類化合物。因此，提高糖基轉(zhuǎn)移酶催化底物的寬泛性，使它能夠?qū)⒏喾N類的糖基引入多種具有重要價(jià)值

3、的小分子中，豐富糖苷類藥物的多樣性，成為研究的重點(diǎn)。酶的體外定向進(jìn)化是蛋白質(zhì)工程的新策略，它主要包含兩個(gè)基本步驟：(1)建立目的基因的突變體庫;(2)對不同突變基因表達(dá)的蛋白進(jìn)行篩選，找到有益突變體。在體外改造酶基因，定向選擇有價(jià)值的非天然酶，這在短期內(nèi)可以在試管中完成，而在自然界需要幾百萬年的進(jìn)化過程，因此，可能是發(fā)現(xiàn)新型酶和新的生理生化反應(yīng)的重要途徑。1GTs的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制盡管GT的序列千差萬別，但出人意料的是如此眾多的家族卻只采用了兩種相類似的折疊方式——Rossmann卷曲，形成GT-A和GT-B兩大超家族。GT-A家族中的蛋白由兩個(gè)緊密相鄰的b/a/b折疊構(gòu)成

4、，而GT-B家族中的蛋白由兩個(gè)b/a/b結(jié)構(gòu)域彼此相對且自由連接。與GT-A超家族不同的是GT-B超家族中沒有“DXD”功能域，“DXD”是一種具有高度保守性的模體，它的作用是將糖基與另外的糖基、磷酸鹽和蛋白結(jié)合。先進(jìn)的分子生物學(xué)手段使得越來越多的折疊形式被我們所知，第三種折疊方式GT-C就是通過BLAST等迭代序列查找技術(shù)而發(fā)現(xiàn)的[17]，其跨膜蛋白的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)還沒有通過實(shí)驗(yàn)來證明。根據(jù)異頭碳的立體構(gòu)型，糖基轉(zhuǎn)移酶分為構(gòu)型翻轉(zhuǎn)型(inverting)和構(gòu)型保持型(retaining)。構(gòu)型翻轉(zhuǎn)型糖基轉(zhuǎn)移酶是通過酶催化激活路易斯酸，使之脫去一份磷酸鹽，完成一個(gè)類似SN2親

5、核取代反應(yīng)。構(gòu)型保持型糖基轉(zhuǎn)移酶，被認(rèn)為符合由Breton等[18]提出的雙置換機(jī)理，即首先產(chǎn)生糖基-酶中間復(fù)合物,接著再與受體完成第二步取代反應(yīng)，但由于一直無法找到對應(yīng)的糖基-酶中間復(fù)合物，所以其反應(yīng)機(jī)制目前尚屬推測。2GTs的定向進(jìn)化體外定向進(jìn)化是改造酶的一種有效的新策略，主要是模擬自然進(jìn)化進(jìn)程，在一種酶的特定位置引入隨機(jī)變異，再經(jīng)由DNA改組、交錯(cuò)延伸過程、隨機(jī)引導(dǎo)重組等進(jìn)行突變基因的體外重組，最終經(jīng)篩選獲得所需活性的酶。2.1　突變庫的構(gòu)建　定向進(jìn)化首先需要構(gòu)建包含大量突變的基因文庫，通常采用隨機(jī)突變和基因重組的方式來進(jìn)行。隨機(jī)突變包括易錯(cuò)PCR(epPCR)和飽

6、和突變(saturationmutation)等；基因重組包括DNA重組(DNAShuffling)、漸進(jìn)式切割產(chǎn)生雜合酶(incrementaltruncationforthecreationofhybridenzymes,ITCHY)、交錯(cuò)延伸法(staggeredextensionprocess,StEP)、隨機(jī)引物體外重組(random-priminginvitrorecombination,RPR)、臨時(shí)模板隨機(jī)嵌合生長(randomchimeragenesisontransienttemplates,RACHITT)、外顯子改組(exonshuffling)和

7、酵母增強(qiáng)組合文庫(combinatoriallibrariesenhancedbyrecombinationinyeast,CLKRY,)以及隨機(jī)片段交換法(randominsertional-deletionalstrandexchangemutagenesis,RAISE)[19]等9種方法。構(gòu)建糖基轉(zhuǎn)移酶突變庫最為常用的是易錯(cuò)PCR、飽和突變和DNA重組等3種方法(表2)。2.2　篩選技術(shù)　定向進(jìn)化的基本規(guī)則：“所篩即所得?！倍ㄏ蜻M(jìn)化的成功與否就在于篩選龐大的突變體文庫。對于糖基轉(zhuǎn)移酶來說，雖然我們掌握了大量糖基轉(zhuǎn)移酶的