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《酶的定向進化技術(shù)研究進展》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、酶的定向進化技術(shù)研究進展摘要隨著科學技術(shù)的發(fā)展人們對酶的各級結(jié)構(gòu)、酶的功能以及酶的催化機制等有了進一步的認識，新的酶或酶的新功能不斷被研究發(fā)現(xiàn)。但是由于酶本身在復雜的工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境屮的穩(wěn)定性、酶活性等特性并不如人意，因此其廣泛應用仍受到限制。而酶的定向進化技術(shù)對酶的改造則使得酶額應用更加廣泛。許多種新酶種類或酶的新特性被開發(fā)出來，這必將對工業(yè)、對農(nóng)業(yè)、對食品業(yè)、對環(huán)境保護、對藥物開發(fā)甚至對人們的生活都產(chǎn)生重要的影響。關(guān)鍵詞：酶，定向進化引言隨著自然科學的迅速發(fā)展，酶學研究也開展的如火如荼，從1926年，美國科學家薩姆鈉(J.B.Sumner,1887—1955)從刀豆種子中提取
2、出腺酶的結(jié)晶，并通過化學實驗證實膿酶是一種蛋白質(zhì)，到20世紀80年代，美國科學家切赫(T.R.Cech,1947—)和奧特曼(S.Altman,1939—)發(fā)現(xiàn)少數(shù)RNA也具有生物催化作用以來，人們對酶的各級結(jié)構(gòu)、酶的功能以及酶的催化機制等有了進一步的認識，新的酶或酶的新功能不斷被研究發(fā)現(xiàn)。如今，酶已經(jīng)應用于釀酒工業(yè)，醬油、食醋的生產(chǎn)，食品添加劑的生產(chǎn)，甚至洗衣粉中也有酶的應用，如加酶洗衣粉，可以使洗衣粉效率提高，使原來不易除去的汗?jié)n等很容易除去等等，酶的應用已具有非常廣闊的前景⑴。由于酶的應用廣泛，酶的提取和合成就成了重要的研究課題。然而，就目前從自然界中發(fā)現(xiàn)和鑒定的幾千種
3、酶來說，真正能夠進行大規(guī)模生產(chǎn)和應用的商品酶卻不多。大量的天然酶尚無法被提取或合成出來，從而在復雜的工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中得到應用。此外，應用于工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境的酶的催化反應條件通常為高溫、高壓、極端pH、高鹽及存在有機溶劑、含有去污劑或氧化劑等極端環(huán)境，而天然酶在這些極端工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中的性質(zhì)發(fā)生了很大變化，甚至變性失活，難以滿足工業(yè)催化的要求。因此需要獲得具有新功能和特性的酶。定向進化技術(shù)出現(xiàn)以前獲得具有新功能和特性的酶的途徑通常為：一是在自然界中尋找，但是由于不具有針對性，很難有滿意的結(jié)果；二是利用定點突變技術(shù)改造現(xiàn)有的酶，但是定點突變技術(shù)只能對現(xiàn)有的酶的少數(shù)氨基酸進行替換、刪除或插
4、入，無法改變酶蛋白的高級結(jié)構(gòu)，對酶的改造有限。定向進化技術(shù)可以人為地改變天然生物催化劑的某些性質(zhì)，從而為酶的公寓應用提供了有效的工具，為新酶的發(fā)現(xiàn)提供了新的途徑，創(chuàng)造了新的機會。該技術(shù)可在實驗室中模擬自然選擇過程來達到酶進化的目的，將酶在自然界需要幾百萬年才能完成的進化過程縮短到幾年、幾個月甚至更短，加速了酶的進化過程，增強在不良環(huán)境中的穩(wěn)定性，甚至創(chuàng)造出新酶種類〔2句。1酶的定向進化的定義酶的定向進化是指在不需要事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和酶的催化機制的條件下，通過各種突變方法向編碼酶蛋白的基因中引入突變，突變的基因可以通過重組如DNA改組等方法進行重新組裝，提高基因進化的效率。
5、這些被改造的基因可以編碼具有新特性的酶蛋白，得到酶蛋白突變文庫，再利用篩選或選擇的方法在酶蛋白突變文庫中獲得具有目的性能的突變株。2酶的定向進化的原理定向進化是利用TaqDNA多聚酶不具有9-5,校對功能的性質(zhì)，并結(jié)合基因工程現(xiàn)有技術(shù)手段，在待進化酶基因的PCR擴增反應中，配合適當條件，以很低的比率向目的基因屮隨機引入突變，并構(gòu)建突變庫。憑借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)優(yōu)化的酶，從而排除其他突變體。定向進化的基本規(guī)則是：“獲取所篩選的突變體”。簡言Z,定向進化就是隨機突變同選擇或篩選相結(jié)合。與自然進化不同，定向進化是受人為控制的，起著選擇某一方向的進化而除掉其他方向突變的作用
6、，整個進化過程完全是在人為條件控制下進行的⑹。3酶的定向進化的方法定向進化包括兩個基本步驟：(1)構(gòu)建目的酶蛋白的突變體庫；(2)對不同突變基因表達的酶蛋白進行篩選，找到目標突變體。3.1構(gòu)建目的酶蛋白的突變體庫目前，構(gòu)建目的酶蛋白的突變體庫的主要方法有易錯PCR、DNAShuffling>隨機引物體外重組法、交錯延仲重組法、3.1.1易錯PCR易錯PCR是在采用DNA聚合酶進行目的基因擴增時，通過調(diào)整反應條件，如提高鎂離子濃度、加入鎰離子、改變體系中四種的dNTPs濃度或運用低保真度DNA聚合酶等，來改變擴增過程中的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因中隨機引入突變，獲得蛋
7、白質(zhì)分子的隨機突變體。其關(guān)鍵在于對合適突變頻率的選擇，突變頻率太高會導致絕大多數(shù)突變?yōu)橛泻ν蛔?，無法篩選到有益突變;突變頻率太低則會導致文庫中全是野生型群體。理想的堿基置換率和易錯的最佳條件主要依賴于突變的DNA片段的長度。為改變細胞色素CYP102A2的催化活性，Axarli和Labrou采用易錯PCR對其進行定向進化實驗,，構(gòu)建突變體庫，通過活力測定篩選突變體。實驗得到的CYP102A2突變體(Prol5Ser)的酶活性明顯加強，并且其底物是一系列的芳香族和脂肪族⑺。3.1.1DNAShufflin
