《酶定向進(jìn)化》PPT課件

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1、第八章酶定向進(jìn)化天然酶的局限天然酶的穩(wěn)定性差,活性低使催化效率很低,還缺乏有商業(yè)價(jià)值的催化功能天然酶的局限性源于酶的自然進(jìn)化過(guò)程.現(xiàn)代生物工程的要求能具備長(zhǎng)期穩(wěn)定性和活性能適用于水及非水相環(huán)境能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物能夠在特殊環(huán)境中合成和拆分制作新藥物或藥物的原材料如何利用相對(duì)簡(jiǎn)單的方法以達(dá)到對(duì)天然酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶就顯得非常有研究意義和應(yīng)用前景.1993年,美國(guó)科學(xué)家ArnoldFH首先提出酶分子的定向進(jìn)化的概念,并用于天然酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶.酶分子定向進(jìn)化簡(jiǎn)稱(chēng)酶定向進(jìn)化，是模擬自然進(jìn)化過(guò)程（隨機(jī)突變和自然選擇），在體外進(jìn)行酶基因

2、的人工隨機(jī)突變，建立突變基因文庫(kù)，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有優(yōu)良催化特征的酶的突變體的技術(shù)過(guò)程。酶定向進(jìn)化的基本過(guò)程隨機(jī)突變、構(gòu)建突變基因文庫(kù)、定向選擇酶定向進(jìn)化的基本過(guò)程：酶基因隨機(jī)突變構(gòu)建突變基因文庫(kù)篩選負(fù)突變基因正突變基因進(jìn)化酶反復(fù)進(jìn)行第一節(jié)酶定向進(jìn)化的特點(diǎn)1.適應(yīng)面廣不需了解酶的結(jié)構(gòu)信息，因此稱(chēng)為非理性化設(shè)計(jì)。2.目的性強(qiáng)3.效果顯著第二節(jié)酶基因的隨機(jī)突變體外隨機(jī)突變的方法：PCR技術(shù)、DNA重排技術(shù)、基因家族重排技術(shù)基因隨機(jī)突變方法的特點(diǎn)P207表8－1一易錯(cuò)PCR技術(shù)可以通過(guò)提高鎂離子濃度、添加一定濃度的錳離子、改變4種底物（dAMP、dTMP

3、、dCMP、dGMP）的濃度比等反應(yīng)條件，使DNA聚合酶在催化基因擴(kuò)增時(shí)，增加堿基配對(duì)錯(cuò)誤的出現(xiàn)頻率，而引起基因突變。特點(diǎn)正突變的概率低，突變基因文庫(kù)較大，文庫(kù)篩選的工作量大，一般適用于較小基因的定向進(jìn)化。實(shí)例枯草桿菌蛋白酶:洗滌劑合成、鞣革和醫(yī)藥領(lǐng)域的重要工業(yè)酶制劑。Chen等采用易錯(cuò)PCR對(duì)該酶進(jìn)行了體外進(jìn)化研究。他們通過(guò)降低反應(yīng)體系中dATP的濃度,對(duì)編碼該酶從第49位氨基酸到C端的DNA片段進(jìn)行易錯(cuò)PCR,經(jīng)篩選得到的幾個(gè)突變株在高濃度的二甲基甲酰胺(DMF)中酶活性明顯提高突變體PC3在60%的DMF中,酶活力是野生型的256倍。將PC3再進(jìn)行兩個(gè)循環(huán)的定向進(jìn)化,

4、得到的突變體13M酶活力比PC3還要高3倍。二DNA重排技術(shù)概念：又稱(chēng)為DNA改組技術(shù)，是從正突變基因文庫(kù)中分離得到的同源DNA，用酶切割成隨機(jī)片斷，經(jīng)過(guò)不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列重新排布而引起基因突變的技術(shù)過(guò)程。DNA重排技術(shù)的基本過(guò)程兩條以上正突變基因DNA隨機(jī)片斷突變基因構(gòu)建突變基因文庫(kù)篩選負(fù)突變基因正突變基因進(jìn)化酶酶切（反復(fù)進(jìn)行）無(wú)引物PCR基因重組酶切三基因家族重排技術(shù)又稱(chēng)為基因家族改組技術(shù)，是從基因家族的若干同源基因出發(fā)，用酶(DNaseⅠ)切割成隨機(jī)片斷，經(jīng)過(guò)不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列發(fā)生重新排布而引起基因突變的技術(shù)過(guò)程?；?/p>

5、因家族重排技術(shù)的基本過(guò)程基因家族若干同源基因酶切DNA隨機(jī)片斷突變基因突變基因文庫(kù)基因重組篩選負(fù)突變基因正突變基因進(jìn)化酶無(wú)引物PCR酶切反復(fù)進(jìn)行DNA家族重排技術(shù)與DNA重排技術(shù)的異同點(diǎn)相同點(diǎn)：DNA家族重排技術(shù)與DNA重排技術(shù)的過(guò)程大致相同，都要經(jīng)過(guò)基因的隨機(jī)切割、無(wú)引物PCR等步驟以獲得突變基因，然后經(jīng)過(guò)構(gòu)建突變基因文庫(kù)、采用高通量篩選技術(shù)篩選獲得正突變基因。不同點(diǎn)：DNA家族重排技術(shù)從基因家族的若干同源基因出發(fā)進(jìn)行DNA序列的重新排布，而后者則從采用易錯(cuò)PCR等技術(shù)所獲得的兩個(gè)以上的正突變基因出發(fā)進(jìn)行DNA序列的重新排布。第三節(jié)酶突變基因的定向選擇突變基因的定向選擇基

6、本過(guò)程突變基因基因載體突變基因文庫(kù)基因重組篩選目的基因一、構(gòu)建突變基因文庫(kù)的主要過(guò)程載體的選擇1）質(zhì)粒載體：微生物細(xì)胞染色體外，閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子。2）噬菌體DNA載體：由噬菌體DNA改造而成的具有自我復(fù)制能力的載體。3）黏粒載體：是一類(lèi)人工構(gòu)建的含有λDNA黏性末端和質(zhì)粒復(fù)制子的質(zhì)粒載體，又稱(chēng)為柯斯質(zhì)粒。4）噬菌粒載體：是一類(lèi)人工構(gòu)建的由M13噬菌體單鏈DNA的基因間隔區(qū)與質(zhì)粒載體結(jié)合而成的基因載體?；蛑亟M在體外通過(guò)DNA連接酶的作用，將基因與載體連接在一起形成重組DNA的技術(shù)過(guò)程。黏性末端連接平頭末端連接修飾末端連接形成基因文庫(kù)將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞或包裝成有感

7、染活性的噬菌體的過(guò)程。重組質(zhì)粒載體：轉(zhuǎn)化重組噬菌體DNA載體：需要用噬菌體外殼蛋白將重組DNA進(jìn)行包裝，稱(chēng)為有感染活性的重組噬菌體，而形成基因文庫(kù)。二、突變基因的篩選（一）定向選擇環(huán)境條件的設(shè)定（1）提高酶的穩(wěn)定性，高溫篩選重組細(xì)胞，每一次突變－篩選的循環(huán)中逐步提高重組細(xì)胞的培養(yǎng)溫度。（2）如果定向進(jìn)化的目的是提高β－內(nèi)酰胺酶的活性，從而提高對(duì)β－內(nèi)酰胺酶類(lèi)抗生素的耐受性，可以通過(guò)在含有一定濃度的β－內(nèi)酰胺酶類(lèi)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組細(xì)胞，并在每一次突變－篩選循環(huán)中逐步提高抗生素的濃度。（二）高通量篩選技術(shù)P217