第十章酶的定向進(jìn)化ppt課件.ppt

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1、第十章酶的定向進(jìn)化(Directedevolution)第一節(jié)酶定向進(jìn)化簡(jiǎn)介第二節(jié)酶分子定向進(jìn)化的歷史第三節(jié)定向進(jìn)化的選擇策略第四節(jié)定向進(jìn)化的應(yīng)用第一節(jié)定向進(jìn)化簡(jiǎn)介一、自然進(jìn)化與定向進(jìn)化二、理論來(lái)源三、概念一、自然進(jìn)化與定向進(jìn)化達(dá)爾文在《物種起源》中提出以自然選擇為基礎(chǔ)的進(jìn)化學(xué)說(shuō)，成為生物學(xué)史上的一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)。1、自然進(jìn)化（1）環(huán)境壓力下物種朝著適應(yīng)生存環(huán)境的方向發(fā)展；（2）漫長(zhǎng)時(shí)間里通過(guò)DNA復(fù)制發(fā)生突變或通過(guò)重組，產(chǎn)生了遺傳多樣性；（3）自發(fā)、非常緩慢、自然選擇；2、定向進(jìn)化是達(dá)爾文的進(jìn)化論思想在核酸、肽或蛋白等分子水平上的延伸和應(yīng)用。它不需要深入了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系，在實(shí)驗(yàn)室條件下

2、人工模擬生物大分子自然進(jìn)化過(guò)程，在體外對(duì)基因進(jìn)行隨機(jī)誘變，使基因發(fā)生大量變異，并定向選擇出所需性質(zhì)的突變體，從而可以在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)自然界幾百萬(wàn)年才能完成的進(jìn)化過(guò)程。人為引發(fā)、較短時(shí)間、人為選擇。3、定向進(jìn)化的一般過(guò)程細(xì)菌誘變500C培養(yǎng)突變體庫(kù)選擇壓力（溫度）溫度耐受型突變體最適生長(zhǎng)溫度為370C4、酶定向進(jìn)化的意義酶作為生物催化劑其專一性和高效性是一般催化劑所不能比擬的，但是天然酶的許多性質(zhì)不適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)的條件。選擇特殊環(huán)境，利用酶定向進(jìn)化技術(shù)重新設(shè)計(jì)及改進(jìn)酶分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，可以逐步接近和滿足將酶催化用于工業(yè)生產(chǎn)的需要。二、理論來(lái)源利用基因工程原理在實(shí)驗(yàn)室中模擬生物進(jìn)化過(guò)程待進(jìn)化酶基因

3、的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，利用TaqDNA多聚酶不具有3′→5′校對(duì)功能的性質(zhì)，配合適當(dāng)條件，以很低的比率向目的基因中隨機(jī)引入突變，構(gòu)建突變庫(kù)，憑借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶(或蛋白質(zhì))，從而排除其他突變體。化學(xué)進(jìn)化生物進(jìn)化是蛋白質(zhì)工程的新策略主要是利用分子生物學(xué)手段，在分子水平創(chuàng)造分子的多樣性，在事先不了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制的情況下，人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制（隨機(jī)突變、基因重組和自然選擇），在體外改造酶基因，并定向選擇（或篩選）出所需性質(zhì)的突變酶。是一種在生物體體外快速模擬達(dá)爾文進(jìn)化的、具有一定目的性和快速改造蛋白質(zhì)的方法，相對(duì)于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)的“理性設(shè)計(jì)”，酶的

4、分子定向進(jìn)化屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計(jì)。三、定向進(jìn)化概念定向進(jìn)化=隨機(jī)突變+正向重組+選擇（或篩選）定向進(jìn)化的過(guò)程（1）通過(guò)隨機(jī)突變和(或)基因體外重組創(chuàng)造基因多樣性；（2）導(dǎo)入適當(dāng)載體后構(gòu)建突變文庫(kù)；（3）通過(guò)靈敏的篩選方法，選擇陽(yáng)性突變子。這個(gè)過(guò)程可重復(fù)循環(huán)，直至得到預(yù)期性狀的酶。20世紀(jì)60年代利用RNA噬菌體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，是第一次在分子水平上定向改造單一分子。SolSpiegelman第二節(jié)酶分子定向進(jìn)化的歷史1981年，B.G.Hall等定向改變E.coliK12中ebg酶的底物專一性，開(kāi)發(fā)出對(duì)幾種糖苷鍵有水解能力的酶。1993年，Arnold研究組提出易錯(cuò)PCR的方法。1994年，St

5、emmer將DNA重組方法引用到酶分子的定向進(jìn)化中。1999年，Stemmer等把DNA改組延伸到族改組。第三節(jié)定向進(jìn)化的選擇策略隨機(jī)突變策略易錯(cuò)PCR、DNA改組和外顯子改組、體外隨機(jī)引發(fā)重組、交錯(cuò)延伸、定位誘變篩選——采用回交法1、易錯(cuò)PCR(error-pronePCR)通過(guò)改變PCR反應(yīng)條件，使擴(kuò)增的基因出現(xiàn)少量堿基錯(cuò)配，從而導(dǎo)致目的基因的隨機(jī)突變。控制DNA的突變頻率。不足之處：靶序列長(zhǎng)度一般在0.5-1.0kb，應(yīng)用范圍有限；中性突變較多；且較為耗時(shí)、費(fèi)力；獲得的DNA序列中堿基的轉(zhuǎn)換高于顛換。此法突變具有一定的密碼偏向性。連續(xù)易錯(cuò)PCR(Sequentialerror-pro

6、nePCR)將一次PCR擴(kuò)增得到的有益突變基因作為下一次PCR擴(kuò)增的模板，連續(xù)反復(fù)進(jìn)行隨機(jī)誘變，使得每一次獲得的少量突變累積而產(chǎn)生重要的有益突變。2、DNA改組1994年，Stemmer在Nature發(fā)表了一篇題為《RapidevolutionofaproteininvitrobyDNAshuffling》的文章，首次提出了DNA改組(DNAshuffling)技術(shù)。Stemmer以β-內(nèi)酰胺酶系統(tǒng)為試驗(yàn)對(duì)象，用DNA改組，經(jīng)過(guò)三輪篩選和兩次回交得到一新菌株，其頭孢噻肟(Cefotaxime)的最低抑制濃度比原始菌株提高了32,000倍，也遠(yuǎn)高于易錯(cuò)PCR的突變篩選結(jié)果。DNA改組是DNA

7、分子的體外重組，是基因在分子水平上有性重組。通過(guò)改變單個(gè)基因(或基因家族)原有核苷酸序列，創(chuàng)造新基因，并賦予表達(dá)產(chǎn)物以新功能。是一種分子水平上的定向進(jìn)化。因此也稱為分子育種。DNA改組的效果必須由改組后的基因表達(dá)產(chǎn)物的功能來(lái)驗(yàn)證。因此，靈敏可靠的篩選方法是DNA改組技術(shù)成功與否的關(guān)鍵。DNA改組原理DNaseI產(chǎn)生隨機(jī)片段；隨機(jī)片段變性；隨機(jī)片段復(fù)性；4.延伸反復(fù)重復(fù)步后，可獲得全長(zhǎng)DNA片段2-4。DNA改組步驟：（1