細(xì)菌分離培養(yǎng)和保存技術(shù)ppt課件.ppt

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1、實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌分離培養(yǎng)和保存技術(shù)蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院謝小芳1實(shí)驗(yàn)程序一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)材料三、實(shí)驗(yàn)方法（一）接種與分離工具（二）接種與分離方法（三）細(xì)菌的培養(yǎng)方法四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容2一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握細(xì)菌的分離培養(yǎng)和接種技術(shù)；2、掌握培養(yǎng)基的制備過(guò)程。31、工具：接種環(huán)、接種針、移液器、酒精燈。2、培養(yǎng)基：（1）血平板、巧克力平板和中國(guó)藍(lán)平板（2）雙糖、半固體、枸櫞酸鹽、6.5%Nacl肉湯3、菌株：大腸埃希菌、糞腸球菌。4、恒溫培養(yǎng)箱。二、實(shí)驗(yàn)材料4三、實(shí)驗(yàn)原理為了獲得純種的微生物，一般根據(jù)該微生物營(yíng)養(yǎng)或培養(yǎng)特點(diǎn)，或?qū)δ撤N抑制劑的耐受性不同，或?qū)δ撤N環(huán)境條件要求不同，從而制

2、作或設(shè)置一些選擇性培養(yǎng)基，或選擇性培養(yǎng)條件，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法或劃線法分離，純化該微生物，直至得到該純種菌株。5接種與分離工具（1）接種環(huán)（2）接種針（3）涂布棒（4）無(wú)菌棉拭子（一）接種與分離工具6（二）培養(yǎng)基按性狀可分為：固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基按用途可分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)基L型培養(yǎng)基7（三）接種與分離方法81．平板劃線分離法對(duì)混有多種細(xì)菌的臨床標(biāo)本，采用劃線分離和培養(yǎng)，使原來(lái)混雜在一起的細(xì)菌沿劃線在瓊脂平板表面分離，得到分散的單個(gè)菌落，以獲得純種。平板劃線分離法通常有兩種方法：（1）分區(qū)劃線分離法（2

3、）連續(xù)劃線分離法（二）接種與分離方法9（1）分區(qū)劃線分離法：此法常用于含菌量較多的標(biāo)本如痰、泌尿生殖道的分泌物和糞便或混合細(xì)菌的分離。劃線時(shí)接種環(huán)與平皿約成30-40度角，輕輕接觸，以腕力在瓊脂表面輕快滑動(dòng)，不能劃破瓊脂。第一次劃線應(yīng)占平皿面積的1/5，以后每次劃線約占面積的1/4—1/5。劃線為連續(xù)劃線，不能間斷應(yīng)占滿平皿，劃線不能交叉重復(fù)。每次劃完后接種環(huán)應(yīng)滅菌。（二）接種與分離方法10分區(qū)劃線分離法：（1）分區(qū)劃線分離法：以四區(qū)劃線最常用。實(shí)驗(yàn)一（二）接種與分離方法（2）連續(xù)劃線分離法：此法常用于含菌量不多的標(biāo)本或培養(yǎng)物中的細(xì)菌分離培養(yǎng)。方法是先將接種物在瓊脂平板

4、上1/5處輕輕涂抹，然后再用接種環(huán)或拭子在平板表面曲線連續(xù)劃線接種，直至劃滿瓊脂平板表面。（二）接種與分離方法13（2）連續(xù)劃線分離法：14思考題1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來(lái)源于上次劃線的末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污

5、染環(huán)境和感染操作者。152.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落。162、斜面接種法主要用于菌落的移種，以獲得純菌種進(jìn)行鑒定和保存菌種等。（1）普通斜面:用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落或培養(yǎng)物，從培養(yǎng)基斜面底部向上劃一條直線，然后再?gòu)牡撞垦刂本€向上曲折連續(xù)劃線，直至斜面近頂端處止。（2）高層斜面：用接種針挑取待

6、鑒定細(xì)菌的菌落，從斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上底部向上劃一條直線，然后由下至上曲折劃線接種。17斜面劃線分離法：183．穿刺接種法此法多用于半固體培養(yǎng)基或明膠等具有高層的培養(yǎng)基接種，半固體培養(yǎng)基的穿刺接種可用于觀察細(xì)菌的動(dòng)力。接種時(shí)用接種針挑取菌落，由培養(yǎng)基中央垂直刺入至距管底0.4cm處，再沿穿刺線退出接種針。194．液體接種法用于各種液體培養(yǎng)基如肉湯、蛋白胨水、糖發(fā)酵管等的接種。用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，傾斜液體培養(yǎng)管，在液面與管壁交界處研磨接種物（以試管直立后液體淹沒接種物為準(zhǔn)）。此接種法應(yīng)避免接種環(huán)與液體過(guò)多接觸，更不應(yīng)在液體中混勻、攪拌，以免形成氣溶膠，造

7、成實(shí)驗(yàn)室污染。205．涂布接種法本法多用于紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)的細(xì)菌接種。將一定量或適量的菌液加到瓊脂培養(yǎng)基表面，然后用滅菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反復(fù)涂布，使被接種液均勻分布于瓊脂表面，然后貼上藥敏紙片，或直接培養(yǎng)，本法經(jīng)培養(yǎng)后細(xì)菌形成菌苔。21涂布接種法226．傾注平板法本法主要用于飲水、飲料、牛乳和尿液等標(biāo)本中的細(xì)菌計(jì)數(shù)。取純培養(yǎng)物的稀釋或原標(biāo)本1ml至無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，再將已融化并冷卻至45~50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基15~20ml傾注入該無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，混勻，待凝固后置37℃培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌落后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，以求出每毫升標(biāo)本中所含菌數(shù)。