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《等孢球蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒說明書.doc》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、等孢球蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒說明書1、試劑盒簡(jiǎn)介貨為了適應(yīng)等孢球蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒快速檢測(cè)和疫病研究的需要，本公司參照OIE國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的引物序列，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)及系統(tǒng)優(yōu)化，開發(fā)生產(chǎn)了本試劑盒。應(yīng)用本試劑盒進(jìn)行檢測(cè)具有快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確、安全操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用廣泛和高通量檢測(cè)等特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)。2、試劑盒組成:試劑盒組成包括核酸提取試劑和核酸擴(kuò)增試劑，具體組成參見表1：表1：試劑盒組成（50test/盒）組成成分體積樣品DNA提取液1樣品DNA提取液25ml×1管500μl×1管核酸擴(kuò)增試劑：DEPC水BPPCR反應(yīng)液Taq酶(5U/ul)陰性對(duì)照BP陽性對(duì)照5ml×1管
2、750μl×1管40μl×1管1ml×1管1ml×1管*保存條件：樣品DNA提取液1、2和試劑盒須在-20℃保存。3、樣本采集，存放及運(yùn)輸3.1樣本采集所用取樣器材必須經(jīng)過高壓滅菌并烘干。取對(duì)蝦的腮絲、肝胰腺、腹肢等組織各30mg標(biāo)記后置于離心管中，按照試劑盒配套的DNA抽提試劑盒操作說明提取DNA模板。3.2存放研磨后的樣本應(yīng)盡快提取DNA；待測(cè)樣本應(yīng)避免凍融。3.3運(yùn)輸采用或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。4、檢測(cè)步驟4.1.1DNA核酸提取操作方法(在樣本處理區(qū)進(jìn)行)：取n個(gè)1.5ml滅菌Eppendorf管，其中n為待檢樣品數(shù)和一管陰性對(duì)照之和，對(duì)每個(gè)管進(jìn)行編號(hào)標(biāo)記。(注：試劑盒中的陽性
3、對(duì)照直接作為PCR檢測(cè)的模板，無需提取核酸)4.1.2每管加入100μlDNA提取液1，然后分別加入待測(cè)樣本和陰性對(duì)照各100μl，一份樣本換用一個(gè)吸頭；混勻器上震蕩混勻5s,于4℃～25℃條件下，12000r/min離心10min。4.1.1盡可能吸棄上清且不碰沉淀，再加入10μlDNA提取液2，混勻器上震蕩混勻5s,于4℃～25℃條件下，2000r/min離心10s。4.1.2100℃干浴或沸水浴10min；加入90μlDEPC水，12000r/min離心10min，吸取上清，即為提取的DNA，冰上保存待用（提取的DNA需在2h內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增或放置于-70℃冰箱內(nèi)保存）。4.2PC
4、R檢測(cè)4.2.1擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行）：從試劑盒中取出相應(yīng)的PCR反應(yīng)液、Taq酶，2000×g離心5秒鐘。每個(gè)樣品測(cè)試反應(yīng)體系配制見下表2。表2每個(gè)樣品測(cè)試反應(yīng)體系配制表試劑PCR反應(yīng)液Taq酶合計(jì)用量14.5μL0.5μL15μL4.2.2加樣（樣本處理區(qū)進(jìn)行）：向每個(gè)PCR管孔中各分裝15μL的混合液，再分別加入樣本DNA模板10μL，蓋緊管蓋，500r/min離心30s。4.2.3PCR檢測(cè)（在檢測(cè)區(qū)進(jìn)行）：階段，95℃/3min；第二階段，94℃/30sec，60℃/30sec；72℃/1min；35個(gè)循環(huán)；第三階段，72℃/7min；第四階段，4℃保存4.3瓊
5、脂糖電泳用電泳緩沖液制備1.5%的瓊脂糖凝膠平板。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好沒過膠面，向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1/6體積的電泳上樣緩沖液（6X上樣緩沖液），按比例混勻后加入樣品孔。在電泳時(shí)設(shè)立DNADL2000Marker做對(duì)照。5V/cm電泳約0.5h，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)一定位置時(shí)停止。在紫外燈下或凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴(kuò)增出預(yù)期的特異性DNA電泳帶，拍攝并記錄。5、結(jié)果判定5.1PCR后，陽性對(duì)照會(huì)出現(xiàn)一條196bp的DN段。陰性對(duì)照和空白對(duì)照沒有該核酸帶。5.2待測(cè)樣品PCR擴(kuò)增后能在相應(yīng)196bpDNA位置上有帶，可判為BP核酸陽性。6、相關(guān)技術(shù)信息F:5’-GAT
6、-CTG-CAA-GAG-GAC-AAA-CC-3’R:5’-TAC-CCT-GCA-TTC-CTT-GTC-GC-3’
