實驗六十淀粉酶產(chǎn)生菌株的篩選.doc

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1、實驗六十淀粉酶產(chǎn)生菌株的篩選實驗項目性質(zhì)：設(shè)計性所涉及的知識點：無菌技術(shù)、富集培養(yǎng)、純種分離、淀粉酶性質(zhì)、酶活測定計劃學時：8學時一、實驗?zāi)康?．掌握從環(huán)境中采集樣品并從中分離純化某種微生物的完整操作步驟。2．鞏固以前所學的微生物學實驗技術(shù)。3．掌握產(chǎn)酶微生物篩選的方法。二、實驗原理α-淀粉酶是一種液化型淀粉酶，它的產(chǎn)生菌芽孢桿菌，廣泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉類物質(zhì)的土壤等樣品中。從自然界篩選菌種的具體做法，大致可以分成以下四個步驟：采樣、增殖培養(yǎng)、純種分離和性能測定。1、采樣：即采集含菌的樣品采集含菌樣品前應(yīng)調(diào)查研究一下

2、自己打算篩選的微生物在哪些地方分布最多，然后才可著手做各項具體工作。在土壤中幾乎各種微生物都可以找到，因而土壤可說是微生物的大本營。在土壤中，數(shù)量最多的當推細菌，其次是放線菌，第三霉菌，酵母菌最少。除土壤以外，其他各類物體上都有相應(yīng)的占優(yōu)勢生長的微生物。例如枯枝、爛葉、腐土和朽木中纖維素分解菌較多，廚房土壤、面粉加工廠和菜園土壤中淀粉的分解菌較多，果實、蜜餞表面酵母菌較多；蔬菜牛奶中乳酸菌較多，油田、煉油廠附近的土壤中石油分解菌較多等。2、增殖培養(yǎng)（又稱豐富培養(yǎng)）增殖培養(yǎng)就是在所采集的土壤等含菌樣品中加入某些物質(zhì)，并創(chuàng)造一些有利

3、于待分離微生物生長的其他條件，使能分解利用這類物質(zhì)的微生物大量繁殖，從而便于我們從其中分離到這類微生物。因此，增殖培養(yǎng)事實上是選擇性培養(yǎng)基的一種實際應(yīng)用。3、純種分離在生產(chǎn)實踐中，一般都應(yīng)用純種微生物進行生產(chǎn)。通過上述的增殖培養(yǎng)只能說我們要分離的微生物從數(shù)量上的劣勢轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)勢，從而提高了篩選的效率，但是要得到純種微生物就必須進行純種分離。純種分離的方法很多，主要有：平板劃線分離法、稀釋分離法、單孢子或單細胞分離法、菌絲尖端切割法等。4、性能測定分離得到純種這只是選種工作的第一步。所分得的純種是否具有生產(chǎn)上所要求的性能，還必須要進

4、行性能測定后才能決定取舍。性能測定的方法分初篩和復(fù)篩兩種。初篩一般在培養(yǎng)皿上根據(jù)選擇性培養(yǎng)基的原理進行。例如要測定淀粉酶的活力可以把斜面上各個菌株一一點種在含有淀粉的培養(yǎng)基表面，經(jīng)過培養(yǎng)后測定透明圈與菌落直徑的比值大小來衡量淀粉酶活力的高低。復(fù)篩是在初篩的基礎(chǔ)上做比較精細的測定。一般是將微生物培養(yǎng)在三角瓶中作搖瓶培養(yǎng)，然后對培養(yǎng)液進行分析測定。在搖瓶培養(yǎng)中，微生物得到充分的空氣，在培養(yǎng)液中分布均勻，因此和發(fā)酵罐的條件比較接近，這樣，測得的結(jié)果更具有實際的意義。三、實驗用品1．器材（1）小鐵鏟和無菌紙或袋。（2）無菌水三角瓶（30

5、0mL的瓶裝水至99mL，內(nèi)有玻璃珠若干）（3）無菌吸管（1mL，5mL等）（4）無菌水試管（每支4.5mL水）（5）無菌培養(yǎng)皿2．試劑（1）分離培養(yǎng)基蛋白胨1%；NaCl?0.5%；牛肉膏0.5%；可溶性淀粉0.2%；瓊脂1.5%；pH7.2；水定容。注：先將可溶性淀粉加少量蒸餾水調(diào)成糊狀，再加到溶化好的培養(yǎng)基中，調(diào)勻。（2）Lugol氏碘液碘1克，碘化鉀2克，水300毫升。配制時先將碘化鉀溶于5-10毫升水中，再加入碘，溶解后定容。四、研究方案研究方案大體步驟：（1）采集樣品，梯度稀釋（2）平板篩選，判斷淀粉酶產(chǎn)生菌產(chǎn)淀粉酶

6、的能力（3）平板劃線分離純化五、實驗建議1．實驗每個步驟都應(yīng)注意無菌操作。2．要進行純種分離以獲得單個的產(chǎn)酶微生物。3．實驗結(jié)束后可根據(jù)實驗現(xiàn)象和結(jié)果，提出超出本實驗所提供器材和試劑的實驗方案，并推測預(yù)期的結(jié)果，從而加深對本實驗的理解。六、思考題1、用平板劃線法進行純種分離的原理是什么?2、要防止平板劃破應(yīng)采取哪些措施？3、為什么要將培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)？附：參考實驗方法：1．采集土樣2．樣品稀釋：在無菌紙上稱取樣品1g，放入100mL無菌水的三角瓶中，手搖10分鐘。80℃水浴15分鐘，冷卻。用1mL無菌吸管吸取0.5mL注入4.5m

7、L無菌水試管中，梯度稀釋至10-6。3．分離：用稀釋樣品的同支吸管分別依次從10-6、10-5、10-4樣品稀釋液中，吸取lmL，注入無菌培養(yǎng)皿中，然后倒入滅菌并融化冷至50℃左右的固體培養(yǎng)基，小心搖動冷凝后，倒置于35℃溫箱中培養(yǎng)48小時。4．檢查：培養(yǎng)48小時后，取出平板，將皿中注入l滴Lugol氏碘液，因淀粉遇碘變藍色，如菌落周圍有無色圈，說明該菌能分解淀粉。5．純化：從平板上選取淀粉水解圈直徑與菌落直徑之比較大的菌落，用接種環(huán)沾取少量培養(yǎng)物至斜面上，并進行2-3次劃線分離，挑取單菌落至斜面上，培養(yǎng)后觀察菌苔生長情況并鏡檢

8、驗證為純培養(yǎng)。